GBT19167-2003 傳染性囊病診斷技術(shù).pdf

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1、ICS65.020.30B41中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19167-2003傳染性囊病診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforinfectiousbursaldisease2003-06-02發(fā)布2003-11-01實(shí)施中華人民共和國(guó)發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.www.bzxzk.com.GB/T19167-2003．告J山～J～NUJ青傳染性囊?。↖BD）又名雞傳染性法氏囊病、腔上囊炎、甘布羅病，是由雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬的傳染性囊病病毒（IBDV）引起的雞和火雞的一種急性、高度

2、接觸傳染性疫病。本標(biāo)準(zhǔn)參考了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織［WorldOrganizationforAnimalHealth（英）,OfficeInternationaldesEpizooties（法）,OIE］的《哺乳動(dòng)物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》所推薦的方法。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所負(fù)責(zé)起草，由廣西獸醫(yī)研究所協(xié)作起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉有昌、劉爵、周蛟、姚煒光、張方亮、賀榮蓮、吳健

3、敏、蘭美益、黃紅梅、蔣冬福、韋志鋒。.www.bzxzk.com.GB/T19167-2003傳染性囊病診斷技術(shù)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了傳染性囊病病毒的病原分離、抗原的檢測(cè)和檢測(cè)特異性抗體的瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒血清微量中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于傳染性囊病的診斷與檢疫。2病毒的分離及其鑒定2.1材料準(zhǔn)備滅菌組織研磨器、離心機(jī)、37℃溫箱、孵化器、滅菌吸管、橡膠吸頭、滅菌小瓶、滅菌6“針頭、滅菌注射器、石蠟。2.2病料的采集和處理采集具有病變的新鮮法氏囊，用加有抗生素（(3000IU/mL青

4、霉素和3000pLg/mL鏈霉素）的胰蛋白酶磷酸緩沖液或生理鹽水制成20％的組織勻漿液，在37℃作用30min-60min,l500r/min離心20min，收集上清液。經(jīng)菌檢培養(yǎng)為陰性后作為接種材料。2.3雞胚接種2.3.1接種將收集的上清液以每只0.2mL的量經(jīng)絨毛尿囊膜接種9日齡～11日齡無(wú)傳染性囊病母源抗體雞胚或SPF雞胚（無(wú)特定病原體雞胚），接種后用石蠟封住接種孔。370C孵育，每天照蛋檢查，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚。2.3.2雞胚剖檢結(jié)果判定2.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)IBDV分離物接種后判定：標(biāo)準(zhǔn)的IBDV

5、分離物接種雞胚后3d^-5d可致雞胚死亡。死亡雞胚充血，在羽毛囊、趾關(guān)節(jié)和大腦有血斑性出血。肝臟多可見(jiàn)壞死，也可見(jiàn)色淡似熟肉樣。2.3.2.2IBDV變異株分離物接種后判定：IBDV變異株經(jīng)絨毛尿囊膜接種雞胚，一般不致死雞胚，接種后5d-6d剖檢，可見(jiàn)雞胚大腦和腹部皮下水腫、發(fā)育遲緩、呈灰白色或奶油色，肝臟常有膽汁著色或壞死，脾臟通常腫大2倍一3倍，但顏色無(wú)明顯變化。2.4易感雛雞接種試驗(yàn)2.4.1接種取2.2述及的病料上清液0.5mL，經(jīng)點(diǎn)眼、口服感染5只14日齡～21日齡無(wú)IBDV母源抗體雞或SPF雞。同

6、時(shí)設(shè)健康對(duì)照組。接種3d后將雞剖殺，檢查法氏囊及脾臟。2.4.2剖檢接種結(jié)果2.4.2.1標(biāo)準(zhǔn)IBDV接種結(jié)果：接種后偶見(jiàn)雞死亡，剖檢可見(jiàn)接種雞法氏囊水腫、色黃，有時(shí)可見(jiàn)出血。脾臟有時(shí)可見(jiàn)輕度腫大，表面有灰色點(diǎn)狀病變。健康雞則正常。2.4.2.2IBDV變異株接種結(jié)果：接種后不出現(xiàn)死亡，3d剖檢可見(jiàn)法氏囊萎縮、質(zhì)度硬，脾臟可見(jiàn)腫大1倍～2倍。健康雞則正常。2.5IBD病毒的鑒定2.5.1瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)用已知的特異性的雞傳染性囊病標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，用分離株的法氏囊勻漿制備待檢抗原，同時(shí)制備正常法氏

7、囊勻漿作對(duì)照抗原，按AGID常規(guī)法滴加抗原和血清進(jìn)行擴(kuò)散，如在抗原孔和血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線者判分離物為陽(yáng)性。.www.bzxzk.com.GB/T19167-20032.5.2直接免疫熒光法2.5.2.1材料及方法2.5.2.1.1高免血清采用CJ801株毒制備的高免血清，經(jīng)AGID測(cè)定效價(jià)為1128以上，經(jīng)中和試驗(yàn)測(cè)定在2'Z(1，2084）以上。2.5.2.1.2直接熒光抗體的制備采用33％飽和硫酸餒鹽析，沉淀免疫球蛋白，經(jīng)透析并通過(guò)SephadexG50柱去鉸離子，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定球蛋白濃度在2

8、0mg/mL-25mg/mL左右，以異硫氫酸熒光素(FITC）按I％量采用熱標(biāo)記方法標(biāo)記，再經(jīng)透析和SephadexG50柱層析，收集熒光抗體，保存于一20℃冰箱備用。2.5.2.1.3標(biāo)本的制備及染色取分離株法氏囊制成冰凍切片或用其組織制成壓片。待自然干燥，以4℃保存的冷丙酮溶液固定10min,0.1mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液沖洗兩次，蒸餾水沖洗一次，風(fēng)干后用1：8-1，16熒光稀釋液為工作