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《GBT19167-2003傳染性囊病診斷技術(shù).doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、GBT19167-2003傳染性囊病診斷技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了傳染性囊病病毒的病原分離、抗原的檢測和檢側(cè)特異性抗體的瓊脂凝膠免疫擴散試驗、病毒血清微量中和試驗技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于傳染性囊病的診斷與檢疫。2病毒的分離及其鑒定2.1材料準(zhǔn)備滅菌組織研磨器、離心機、37℃溫箱、孵化器、滅菌吸管、橡膠吸頭、滅菌小瓶、滅菌6#針頭、滅菌注射器、石蠟。2.2病料的采集和處理采集具有病變的新鮮法氏囊，用加有抗生素(3000IU/ml青霉素和3000μg/ml鏈霉素)的胰蛋白酶磷酸緩沖液或生理鹽水制成20%的組織勻漿液，在37℃作用30
2、min-60min，l500r/min離心20min，收集上清液。經(jīng)菌檢培養(yǎng)為陰性后作為接種材料。2.3雞胚接種2.3.1接種將收集的上清液以每只0.2ml的量經(jīng)絨毛尿囊膜接種9日齡-11日齡無傳染性囊病母源抗體雞胚或SPF雞胚(無特定病原體雞胚)，接種后用石蠟封住接種孔。370C孵育，每天照蛋檢查，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚。2.3.2雞胚剖檢結(jié)果判定2.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)IBDV分離物接種后判定：標(biāo)準(zhǔn)的IBDV分離物接種雞胚后3d-5d可致雞胚死亡。死亡雞胚充血，在羽毛囊、趾關(guān)節(jié)和大腦有血斑性出血。肝臟多可壞死，也可見色淡似熟
3、肉樣。2.3.2.2IBDV變異株分離物接種后判定：IBDV變異株經(jīng)毛尿囊膜接種雞胚，-般不致死雞胚，接種后5d-6d剖檢，可見雞胚大腦和腹部皮下水腫、發(fā)育遲緩、呈灰白色或奶油色，肝臟常有膽汁著色或壞死，脾臟通常腫大2倍-3倍，但顏色無明顯變化。2.4易感雛雞接種試驗2.4.1接種取2.2述及的病料上清液0.5ML，經(jīng)點眼、口服感染5只14日齡-21日齡無IBDV母源抗體雞或SPF雞。同時設(shè)健康對照組。接種3d后將雞剖殺，檢查法氏囊及脾臟。2.4.2剖檢接種結(jié)果2.4.2.1標(biāo)準(zhǔn)IBDV接種結(jié)果：接種后偶見雞死亡，剖檢可見
4、接種雞法氏囊水腫、色黃，有時可見出血。脾臟有時可見輕度腫大，表面有灰色點狀病變。健康雞則正常。2.4.2.2IBDV變異株接種結(jié)果：接種后不出現(xiàn)死亡，3d剖檢可見法氏囊萎縮、質(zhì)度硬，脾臟可見腫大1倍-2倍。健康雞則正常。2.5IBD病毒的鑒定2.5.1瓊脂凝膠免疫擴散(AGID)試驗用已知的特異性的雞傳染性囊病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，用分離株的法氏囊勻漿制備待檢抗原，同時制備正常法氏囊勻漿作對照抗原，按AGID常規(guī)法滴加抗原和血清進行擴散，如在抗原孔和血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線者判分離物為陽性。2.5.2直接免疫熒光法2.5.2.1材
5、料及方法2.5.2.1.1高免血清采用CJ801株毒制備的高免血清，經(jīng)AGID測定效價為1：128以上，經(jīng)中和試驗測定在212(1：2084)以上。2.5.2.1.2直接熒光抗體的制備采用33%飽和硫酸錢鹽析，沉淀免疫球蛋白，經(jīng)透析并通過SePhadexG50柱去銨離子，用紫外分光光度計測定球蛋白濃度在20mg/ml-25mg/ml左右，以異硫氫酸熒光素(FITC)按1%量采用熱標(biāo)記方法標(biāo)記，再經(jīng)透析和SePhadexG50柱層析，收集熒光抗體，保存于-20℃冰箱備用。2.5.2.1.3標(biāo)本的制備及染色取分離株法氏囊制成冰
6、凍切片或用其組織制成壓片。待自然干燥，以4℃保存的冷丙酮溶液固定10min，0.1mol/l，PH7.2磷酸鹽緩沖液沖洗兩次,蒸餾水沖洗一次，風(fēng)干后用1：8–1：16熒光稀釋液為工作液，滴加在切片上置濕盒中，在37℃溫箱中靜置30min，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液、蒸餾水沖洗，風(fēng)干，滴加甘油緩沖液封固、鏡檢。2.5.2.2鏡檢及判定標(biāo)準(zhǔn)用熒光顯微鏡檢查。采用法氏囊冰凍切片為熒光診斷標(biāo)本，法氏囊病毒侵害法氏囊后主要表現(xiàn)在淋巴小葉的髓質(zhì)部。首先在淋巴濾胞胞漿中發(fā)出黃綠色熒光顆粒，胞核位于中間為暗色不發(fā)光。感染初期常見到“光輪”樣結(jié)構(gòu)的淋
7、巴濾胞，感染最嚴(yán)重時由于大量病毒在泡漿中復(fù)制發(fā)出強熒光的亮斑。皮質(zhì)不發(fā)光。具有上述淋巴圖像稱為特異性熒光，判為陽性。根據(jù)熒光強弱，熒光細(xì)胞的數(shù)量及熒光結(jié)構(gòu)的清晰度可判為“++++、+++、++、+”。淋巴小葉結(jié)構(gòu)完整而清晰，又不發(fā)熒光者判為陰性。瓊脂凝膠免疫擴散3.1材料準(zhǔn)備3.1.1雞傳染性囊病診斷抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。3.1.2瓊脂板制備方法見附錄AA3.1.3被檢血清樣品：被檢雞血清應(yīng)新鮮，分離后56℃滅活30min，采血后分離的血清可以當(dāng)天使用，也可置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2操作程序3.2.1打孔反應(yīng)孔按畫好的七孔圖
8、案打孔，將畫好的七孔圖案放在有瓊脂板的平皿下，按照圖案在固定位置用不銹鋼小管打孔，中心孔徑3mm，外周孔徑3mm，外周孔與中間孔間距3mm，打孔時切下的瓊脂可以吸也可以用針頭挑出。打好后，在酒精燈上適當(dāng)加熱平皿底部，使瓊脂與玻璃平皿貼緊，避免由于打孔時導(dǎo)致的瓊脂與平皿脫離。3.2.2加樣3.2.2.1抗
