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《GBT 19167-2003 傳染性囊病診斷技術》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS65.020.30B41中華人民共和國國家標準GB/T19167-2003傳染性囊病診斷技術Diagnostictechniquesforinfectiousbursaldisease2003-06-02發(fā)布2003-11-01實施中華人民共和國發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局GB/T19167-2003．告J山～J～NUJ青傳染性囊?。↖BD）又名雞傳染性法氏囊病、腔上囊炎、甘布羅病，是由雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬的傳染性囊病病毒（IBDV）引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸傳染性疫病。本標準參考了世界動物衛(wèi)生組織［WorldOrga
2、nizationforAnimalHealth（英）,OfficeInternationaldesEpizooties（法）,OIE］的《哺乳動物、禽、蜜蜂A和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊》所推薦的方法。本標準的附錄A為規(guī)范性附錄。本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。本標準由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所負責起草，由廣西獸醫(yī)研究所協(xié)作起草。本標準主要起草人：劉有昌、劉爵、周蛟、姚煒光、張方亮、賀榮蓮、吳健敏、蘭美益、黃紅梅、蔣冬福、韋志鋒。GB/T19167-2003傳染性囊病診斷技術范圍本標準規(guī)定了
3、傳染性囊病病毒的病原分離、抗原的檢測和檢測特異性抗體的瓊脂凝膠免疫擴散試驗、病毒血清微量中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗的技術要求。本標準適用于傳染性囊病的診斷與檢疫。2病毒的分離及其鑒定2.1材料準備滅菌組織研磨器、離心機、37℃溫箱、孵化器、滅菌吸管、橡膠吸頭、滅菌小瓶、滅菌6“針頭、滅菌注射器、石蠟。2.2病料的采集和處理采集具有病變的新鮮法氏囊，用加有抗生素（(3000IU/mL青霉素和3000pLg/mL鏈霉素）的胰蛋白酶磷酸緩沖液或生理鹽水制成20％的組織勻漿液，在37℃作用30min-60min,l500r/min離心20min，收集
4、上清液。經(jīng)菌檢培養(yǎng)為陰性后作為接種材料。2.3雞胚接種2.3.1接種將收集的上清液以每只0.2mL的量經(jīng)絨毛尿囊膜接種9日齡～11日齡無傳染性囊病母源抗體雞胚或SPF雞胚（無特定病原體雞胚），接種后用石蠟封住接種孔。370C孵育，每天照蛋檢查，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚。2.3.2雞胚剖檢結(jié)果判定2.3.2.1標準IBDV分離物接種后判定：標準的IBDV分離物接種雞胚后3d^-5d可致雞胚死亡。死亡雞胚充血，在羽毛囊、趾關節(jié)和大腦有血斑性出血。肝臟多可見壞死，也可見色淡似熟肉樣。2.3.2.2IBDV變異株分離物接種后判定：IBDV變異株經(jīng)絨毛尿
5、囊膜接種雞胚，一般不致死雞胚，接種后5d-6d剖檢，可見雞胚大腦和腹部皮下水腫、發(fā)育遲緩、呈灰白色或奶油色，肝臟常有膽汁著色或壞死，脾臟通常腫大2倍一3倍，但顏色無明顯變化。2.4易感雛雞接種試驗2.4.1接種取2.2述及的病料上清液0.5mL，經(jīng)點眼、口服感染5只14日齡～21日齡無IBDV母源抗體雞或SPF雞。同時設健康對照組。接種3d后將雞剖殺，檢查法氏囊及脾臟。2.4.2剖檢接種結(jié)果2.4.2.1標準IBDV接種結(jié)果：接種后偶見雞死亡，剖檢可見接種雞法氏囊水腫、色黃，有時可見出血。脾臟有時可見輕度腫大，表面有灰色點狀病變。健康雞則正常
6、。2.4.2.2IBDV變異株接種結(jié)果：接種后不出現(xiàn)死亡，3d剖檢可見法氏囊萎縮、質(zhì)度硬，脾臟可見腫大1倍～2倍。健康雞則正常。2.5IBD病毒的鑒定2.5.1瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）試驗用已知的特異性的雞傳染性囊病標準陽性血清，用分離株的法氏囊勻漿制備待檢抗原，同時制備正常法氏囊勻漿作對照抗原，按AGID常規(guī)法滴加抗原和血清進行擴散，如在抗原孔和血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線者判分離物為陽性。GB/T19167-20032.5.2直接免疫熒光法2.5.2.1材料及方法2.5.2.1.1高免血清采用CJ801株毒制備的高免血清，經(jīng)AGID測定效
7、價為1128以上，經(jīng)中和試驗測定在2'Z(1，2084）以上。2.5.2.1.2直接熒光抗體的制備采用33％飽和硫酸餒鹽析，沉淀免疫球蛋白，經(jīng)透析并通過SephadexG50柱去鉸離子，用紫外分光光度計測定球蛋白濃度在20mg/mL-25mg/mL左右，以異硫氫酸熒光素(FITC）按I％量采用熱標記方法標記，再經(jīng)透析和SephadexG50柱層析，收集熒光抗體，保存于一20℃冰箱備用。2.5.2.1.3標本的制備及染色取分離株法氏囊制成冰凍切片或用其組織制成壓片。待自然干燥，以4℃保存的冷丙酮溶液固定10min,0.1mol/LpH7.2磷酸
8、鹽緩沖液沖洗兩次，蒸餾水沖洗一次，風干后用1：8-1，16熒光稀釋液為工作液，滴加在切片上置濕盒中，在370C溫箱中靜置30min，再經(jīng)磷酸鹽緩沖液、蒸餾水沖洗，風
