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《GBT19438.4-2004 H9亞型禽流感病毒熒光 RT-PCR 檢測方法.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS11.220一一B‘’湯日中華人民共和國國家標準GB/T19438.4-2004H9亞型禽流感病毒熒光RTP'CR檢測方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofavianinfluenzavirussubtypeH9www.bzfxw.com2004-02-14發(fā)布2004-02-15實施中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局．＊小-r-19I/N.91V1#19臂秘，花瞥撞臀豁薈發(fā)布1%11WGB/T19438.4-2004前．勺GB/T19438-2004《禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》分為以下四個部分：—GB/T19438.
2、1-2004《禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》；—GB/T19438.2-2004((H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》；—GB/T19438.3-2004((H7亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》；—GB/T19438.4-2004((H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》。本部分的附錄A是資料性附錄。本部分由中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局提出。本部分起草單位：中華人民共和國北京出人境檢驗檢疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：張利峰、張鶴曉、劉繼紅、郭晉優(yōu)、劉艷華、楊偉。www.bzfxw.comGB/T19438.4-2004H
3、9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法1范圍本部分規(guī)定了熒光RT-PCR檢測H9亞型禽流感病毒的操作方法。本部分適用于活禽及其產品中H9亞型禽流感病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵根據本部分達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法3縮略語下列縮略語適用于本部分。3.1熒光RT-PCR熒光反轉錄一聚合酶鏈反應。3.2Ct值每個
4、反應管內的熒光信號達到設定的IA值時所經歷的循環(huán)數。3.3RNA核糖核酸。3.4DEPC焦碳酸乙二醋。3.5PBS磷酸鹽緩沖鹽水。3.6Taq醉www.bzfxw.comTaqDNA聚合酶。4原理H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法是采用TagMan技術。設計一對僅在H9亞型禽流感病毒血凝素基因間保守的特異性引物和一條特異性的熒光雙標記探針。探針的5’端和3’端分別標記不同的熒光素，如5‘端標記FAM熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測儀器接收，稱為報告熒光基團（用R表示）,3‘端一般標記TAMRA熒光素，它在近距離內能吸收5'端報告熒光基團發(fā)出的熒光信號，稱為淬滅熒光基團（用Q表示）。當
5、PCR反應在退火階段時，一對引物和一條探針同時與目的基因片段結合，此時探針上R基團發(fā)GB/T19438.4-2004出的熒光信號被Q基團所吸收，儀器檢測不到R所發(fā)出的熒光信號，當PCR反應進行到延伸階段時，Taq酶在引物的引導下，以四種核昔酸為底物，根據堿基配對的原則，沿著模板鏈合成新鏈；當鏈的延伸進行到探針結合部位時，受到探針的阻礙而無法繼續(xù)，此時的Taq酶發(fā)揮它的5'-3’外切核酸酶的功能，將探針切成單核昔酸，消除阻礙，與此同時標記在探針上的R基團游離出來，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測儀所接收；在Taq酶的作用下繼續(xù)延伸過程合成完整的新鏈，R和Q基團均游離于溶液中，儀器可繼續(xù)檢
6、測到R所發(fā)出的熒光信號。5材料與試劑5.1試劑除特別說明以外，本標準所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器（用DEPC水處理后高壓滅菌）分裝。5.1.1三氯甲烷。5.1.2異丙醇(-200C預冷）。5.1.3PBS;配方見GB/T19438.1--2004中附錄A,1210C士2'C,15min高壓滅菌冷卻后，無菌條件下加人青霉素、鏈霉素各10000IU/mL.5.1.475％乙醇：用新開啟的無水乙醇和無RNA酶的水配制，-200C預冷。5.1.5H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒‘’：組成、說明及使用注意事項參見附錄A,5.2儀器與器材5.2.1熒光RT-PCR檢
7、測儀。5.2.2高速臺式冷凍離心機（最高轉速12000r/min以上）。5.2.3臺式離心機（最高轉速2000r/min),5.2.4混勻器。5.2.5冰箱（(20C^-8℃和一20℃兩種）。5.2.6可移動紫外燈。5.2.7微量可調移液器及配套帶濾芯吸頭（10uL,100pI_,1000p.L),5.2.8專用毛細玻璃管或PCR管。5.2.9Eppendorf管（1.5ml-)。6抽樣6.1采樣工具下列采樣工具必須經1
