GBT 19438.4-2004 H9亞型禽流感病毒熒光 RT-PCR 檢測(cè)方法

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1、ICS11.220一一B‘’湯日中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19438.4-2004H9亞型禽流感病毒熒光RTP'CR檢測(cè)方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofavianinfluenzavirussubtypeH92004-02-14發(fā)布2004-02-15實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．＊小-r-19I/N.91V1#19臂秘，花瞥撞臀豁薈發(fā)布1%11WGB/T19438.4-2004前．勺GB/T19438-2004《禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》分為以下四個(gè)部分：—GB/T19438.

2、1-2004《禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法》；—GB/T19438.2-2004((H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》；—GB/T19438.3-2004((H7亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》；—GB/T19438.4-2004((H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》。本部分的附錄A是資料性附錄。本部分由中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局提出。本部分起草單位：中華人民共和國(guó)北京出人境檢驗(yàn)檢疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人：張利峰、張鶴曉、劉繼紅、郭晉優(yōu)、劉艷華、楊偉。GB/T19438.4-2004H

3、9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法1范圍本部分規(guī)定了熒光RT-PCR檢測(cè)H9亞型禽流感病毒的操作方法。本部分適用于活禽及其產(chǎn)品中H9亞型禽流感病毒的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本部分，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本部分達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法3縮略語下列縮略語適用于本部分。3.1熒光RT-PCR熒光反轉(zhuǎn)錄一聚合

4、酶鏈反應(yīng)。3.2Ct值每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的IA值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。3.3RNA核糖核酸。3.4DEPC焦碳酸乙二醋。3.5PBS磷酸鹽緩沖鹽水。3.6Taq醉TaqDNA聚合酶。4原理H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法是采用TagMan技術(shù)。設(shè)計(jì)一對(duì)僅在H9亞型禽流感病毒血凝素基因間保守的特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針。探針的5’端和3’端分別標(biāo)記不同的熒光素，如5‘端標(biāo)記FAM熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測(cè)儀器接收，稱為報(bào)告熒光基團(tuán)（用R表示）,3‘端一般標(biāo)記TAMRA熒光素，它在近距離內(nèi)能吸收5'端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，稱為淬

5、滅熒光基團(tuán)（用Q表示）。當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時(shí)，一對(duì)引物和一條探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)GB/T19438.4-2004出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到R所發(fā)出的熒光信號(hào)，當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種核昔酸為底物，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，沿著模板鏈合成新鏈；當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位時(shí)，受到探針的阻礙而無法繼續(xù)，此時(shí)的Taq酶發(fā)揮它的5'-3’外切核酸酶的功能，將探針切成單核昔酸，消除阻礙，與此同時(shí)標(biāo)記在探針上的R基團(tuán)游離出來，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測(cè)儀所接收；在Taq酶的作用下繼續(xù)延伸過程合

6、成完整的新鏈，R和Q基團(tuán)均游離于溶液中，儀器可繼續(xù)檢測(cè)到R所發(fā)出的熒光信號(hào)。5材料與試劑5.1試劑除特別說明以外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器（用DEPC水處理后高壓滅菌）分裝。5.1.1三氯甲烷。5.1.2異丙醇(-200C預(yù)冷）。5.1.3PBS;配方見GB/T19438.1--2004中附錄A,1210C士2'C,15min高壓滅菌冷卻后，無菌條件下加人青霉素、鏈霉素各10000IU/mL.5.1.475％乙醇：用新開啟的無水乙醇和無RNA酶的水配制，-200C預(yù)冷。5.1.5H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒‘’：組

7、成、說明及使用注意事項(xiàng)參見附錄A,5.2儀器與器材5.2.1熒光RT-PCR檢測(cè)儀。5.2.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000r/min以上）。5.2.3臺(tái)式離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速2000r/min),5.2.4混勻器。5.2.5冰箱（(20C^-8℃和一20℃兩種）。5.2.6可移動(dòng)紫外燈。5.2.7微量可調(diào)移液器及配套帶濾芯吸頭（10uL,100pI_,1000p.L),5.2.8專用毛細(xì)玻璃管或PCR管。5.2.9Eppendorf管（1.5ml-)。6抽樣6.1采樣工具下列采樣工具必須經(jīng)121℃士2'C,15min高壓滅菌并烘干：—一棉拭子；—剪刀、鑷子；

8、一一注射器