質(zhì)粒DNA的提取及電泳

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1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)當(dāng)你翻開(kāi)書本的時(shí)候，你必須盡可能地展開(kāi)想象的“翅膀”，否則，你就不能走在別人的前面;而當(dāng)你進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要象脫下你的外衣那樣脫下你的想象力，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作中不能有一丁點(diǎn)兒的想象，否則，你對(duì)事物的觀察就會(huì)受到影響。實(shí)驗(yàn)相關(guān)知識(shí)1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:2、實(shí)驗(yàn)室安全與衛(wèi)生3、分組與實(shí)驗(yàn)操作4、實(shí)驗(yàn)報(bào)告與成績(jī)?cè)u(píng)定離心機(jī)的使用移液器的使用實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的提取純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)與掌握最常用的質(zhì)粒DNA的提取與純化方法實(shí)驗(yàn)原理:堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。DNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致DNA變性，如加熱、極

2、端PH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性SDS是一種陰離子表面活性劑，即可使細(xì)菌裂解，又可使蛋白變性，因此用SDS處理細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA和基因組DNA同時(shí)從細(xì)胞中釋放出來(lái)。釋放出的DNA在強(qiáng)堿的作用下發(fā)生變性，再用酸性醋酸鉀（KAc）緩沖液中和，質(zhì)粒DNA迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA分子量太大不能復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA在上清中，而基因組DNA與細(xì)胞碎片一起沉淀至離心管底部。通過(guò)這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來(lái)試劑準(zhǔn)備溶液Ⅰ:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）。1MT

3、ris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。溶液Ⅱ：0.2NNaOH，1%SDS。0.4NNaOH，2%SDS使用前等體積混合，臨時(shí)配置。溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。5MKAc60ml，冰醋酸11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保存?zhèn)溆谩７?氯仿/異戊醇（25：24：1）操作步驟在50毫升的LB培養(yǎng)基中加入50微升氨芐青霉素（終濃度50微克/毫升），接入含PUC19的大腸桿菌，37度過(guò)夜培養(yǎng)。取1ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心1200

4、0轉(zhuǎn)×30s，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡，將10毫升菌體收集在1個(gè)小指管中。將細(xì)菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖?，故離心管中菌液逐漸變清）。加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，可在冰上放置15min。12000轉(zhuǎn)，10分鐘，將上清移到另一個(gè)小指管中。（溶液Ⅲ為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。）加入等體積的酚/

5、氯仿/異戊醇，振蕩混勻，離心12000轉(zhuǎn)×10min，將上清移到另一個(gè)小指管中。加入等體積的氯仿/異戊醇，振蕩混勻，離心12000轉(zhuǎn)×10min，將上清移到另一個(gè)小指管中。加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，旋渦混勻，-20℃放置30min，離心12000轉(zhuǎn)×10min，去上清。1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次（每次離心12000轉(zhuǎn)×5min），棄上清，將沉淀在室溫下晾干。沉淀溶于20μlTE緩沖液（超純水），-20℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA的構(gòu)型實(shí)驗(yàn)原理：閉合環(huán)狀質(zhì)粒、線性質(zhì)粒和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA由于構(gòu)形不同，在加溴化

6、乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)不同的遷移率，因而在紫外燈下觀察，能區(qū)別閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA、線性質(zhì)粒DNA和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)方法選擇合適的水平式電泳槽，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平。選擇孔徑大小合適的點(diǎn)樣梳子，垂直架在電泳膠模的一端，使點(diǎn)樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為1.0mm。制備1%瓊脂糖凝膠。（0.2克瓊脂糖，加20毫升0.5倍的TBE）將電泳膠模四周密封好，防止?jié)补喹傊悄z板時(shí)發(fā)生滲透。待瓊脂糖凝膠冷卻至60℃左右時(shí)，加入一滴溴化乙錠，搖勻，輕輕倒入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在3～5mm。倒膠時(shí)要避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。瓊脂糖凝膠凝固后，在室溫放置20分鐘

7、，小心拔掉點(diǎn)樣梳子和電泳膠模兩端的擋板，保持點(diǎn)樣孔的完好。將電泳膠模放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面1～2mm。如點(diǎn)樣孔內(nèi)有氣泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。將DNA樣品與1/5體積的溴酚藍(lán)指示劑點(diǎn)樣緩沖液混合。用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內(nèi)，記錄樣品點(diǎn)樣秩序。蓋上電泳槽，開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)，最高電壓不超過(guò)5V/cm（100～150V恒壓電泳），使DNA從負(fù)極向正極移動(dòng)。電泳一般需1～2小時(shí)。電泳完畢后關(guān)閉電源，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡可能將所有的電泳緩沖液淋干，在紫外