資源描述:
《重組子導(dǎo)入和篩選精美生物醫(yī)學(xué)》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、重組子導(dǎo)入、表達(dá)與篩選找找看……重組DNA導(dǎo)入的目的是什么?請簡單描述需要被純化掉的對象轉(zhuǎn)化率是什么?該怎么計算表達(dá)?影響轉(zhuǎn)化率的因素是什么?一、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞什么是轉(zhuǎn)化(transformation)?將重組DNA分子引入細(xì)菌(原核細(xì)胞),使其在細(xì)菌體內(nèi)擴增及表達(dá)的過程。什么是轉(zhuǎn)染(transfection)?將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。基因重組轉(zhuǎn)染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝1原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(細(xì)菌轉(zhuǎn)化)1)受體細(xì)胞的選擇限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型:避免重組整合轉(zhuǎn)化親和型:較高的可轉(zhuǎn)化性
2、遺傳互補型:利于篩選感染缺陷型:防止感染宿主細(xì)胞原核細(xì)胞:大腸桿菌真核細(xì)胞:哺乳類動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞重組體分子導(dǎo)入原核細(xì)胞感受態(tài)細(xì)菌:細(xì)菌表面正電荷增加,細(xì)胞壁和膜的通透性增加,利于DNA分子的吸附和吸收(1)CaCl2轉(zhuǎn)化:細(xì)菌處于0度,二價陽離子存在的低滲溶液中,細(xì)菌膨脹成球形,處于感受態(tài)。此時加熱在42度的熱沖擊下進(jìn)入細(xì)胞,在培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后球形細(xì)胞恢復(fù)原狀并繁殖。轉(zhuǎn)化效率為105~106/ug(2)電擊法(electroporation):在高壓脈沖下,細(xì)菌細(xì)胞表面形成暫時性微孔,重組DNA進(jìn)入微孔后,脈沖結(jié)束,細(xì)胞恢復(fù)。
3、實驗簡單,不需要制備感受態(tài)菌,轉(zhuǎn)化效率高109~1010/ug[原理]利用高壓脈沖,在細(xì)菌細(xì)胞表面形成暫時性的微孔,重組DNA從微孔中進(jìn)入,脈沖過后,微孔復(fù)原,在豐富培養(yǎng)基中生長數(shù)小時后,細(xì)胞增殖,重組DNA得到大量復(fù)制。3)轉(zhuǎn)化率:DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化子的效率什么叫轉(zhuǎn)化子?導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的宿主細(xì)胞什么叫重組子?導(dǎo)入的外源DNA為重組DNA的轉(zhuǎn)化子表達(dá)方式:A、轉(zhuǎn)化子數(shù)/用于轉(zhuǎn)化的DNA分子總數(shù)B、轉(zhuǎn)化子數(shù)/宿主細(xì)胞總數(shù)計算示例,見書132頁影響因素:重組DNA:分子量小,轉(zhuǎn)化率高;親和性強的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率高;ccc質(zhì)粒D
4、NA載體轉(zhuǎn)化率高受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法:電擊法轉(zhuǎn)化率最高;氯化鈣法次之(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2、導(dǎo)入植物細(xì)胞基因槍法基因槍法(genegun)是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。(二)基因槍介法優(yōu)點:(1)無宿主限制。可以對任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究;(2)靶受體幾乎包括所有具有潛在分化能力的組織或細(xì)胞。(3)易于操作。缺點:如轉(zhuǎn)化頻率低、結(jié)果的重復(fù)性差,易導(dǎo)致基因沉默,實驗成本較高等。(二)基因槍法3、導(dǎo)入動物細(xì)胞顯微注射技術(shù)含目的基因的表達(dá)載體動物受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性動物輸卵管或子宮轉(zhuǎn)基因動物顯微注射分裂分化移植發(fā)育脂
5、質(zhì)體法重組體脂質(zhì)體受體細(xì)胞含有目的基因的重組宿主細(xì)胞(如細(xì)菌)可以通過規(guī)模化的基因工程生產(chǎn)目的蛋白(如激素)找找看……基因表達(dá)系統(tǒng)有哪些?基因表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該具有什么條件?重組子篩選的意義是什么?有哪些方法可以用來篩選重組子?最佳的基因表達(dá)體系:⑴目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高;⑵表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定;⑶生物活性高;⑷表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。第一節(jié)基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)策略宿主細(xì)胞的選擇一、適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞的要求:1、容易獲得較高濃度的細(xì)胞;2、能利用易得廉價原料;3、不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素;4、發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài);5、容易進(jìn)行代謝調(diào)控;6、
6、容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作;7、產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高,8、產(chǎn)物容易提取純化。二、宿主細(xì)胞分為兩大類:1、原核細(xì)胞:常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等;2、真核細(xì)胞:常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞等。大腸桿菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。優(yōu)越性:①對大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識和基因表達(dá)的調(diào)控機理已有了深刻了解。②有各類菌株和載體系列。③目前以實現(xiàn)多種基因的高效表達(dá)。表達(dá)基因產(chǎn)物形式多樣:細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)(包含體)、細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等。④易培養(yǎng),成本低。缺點:①大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號肽,產(chǎn)品多為胞
7、內(nèi)產(chǎn)物,提取困難。②因分泌能力不足,真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體,表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。③蛋白質(zhì)不能糖基化。產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個蛋氨酸殘基。④其內(nèi)毒素很難除去。酵母酵母菌是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小,世代時間短,有單倍體雙倍體兩種形式,繁殖迅速,無毒性。能外分泌,產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)。重組子的篩選和鑒定(一)根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選1根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記進(jìn)行篩選載體上的抗藥基因:抗氨芐青霉素基因抗四環(huán)素基因抗卡那霉素基因等凡是轉(zhuǎn)入了載體的細(xì)胞都獲得了這種抗藥性,可以在平板上生長菌落。當(dāng)帶有完整
8、抗藥性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗藥性細(xì)胞后,凡轉(zhuǎn)入載體的細(xì)胞都獲得了抗藥性,能在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上生長成菌落,而未被轉(zhuǎn)化的宿