薄層色譜的操作

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1、薄層色譜的操作1.方法原理薄層色譜是一種微量分析的分離過程，它將樣品點(diǎn)在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上,利用流動相在特定的展開室中將混合物中的組份推移到不同距離處，在色譜展開整個(gè)過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。(1)流動相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過固定相。(2)樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極-（誘導(dǎo)）-偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機(jī)理。由于樣品組份與流動相和固定相之間的相互作用力程度不同，整個(gè)毛細(xì)管流動過程中分離運(yùn)動都在進(jìn)行?；?/p>

2、于這點(diǎn)，TLC系統(tǒng)（流動相和固定相）必須與樣品很好地匹配。用顯色試劑處理，許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用光密度計(jì)和照相機(jī)記錄或影像系統(tǒng)方法來評價(jià)。2.薄層板2.1手工自制板2.1.1玻璃板的要求:用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔、平整，最好使用厚薄1~2mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時(shí)，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求2.1.2制作方法:除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠G一

3、般加3份水），在研缽中用研杵沿一個(gè)方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的膠漿,立即傾入涂布器中,均勻地向前推進(jìn)涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布;涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干,再在規(guī)定的溫度(一般為105℃~110℃)下烘約30分鐘活化,貯于干燥器中備用。薄層板的厚度一般為0.25~0.5mm.。2.2商品化供應(yīng)的預(yù)制板和高效板2.2.1板的尺寸20x20cm10x20cm20x10cm10x10cm圖1不同的板尺寸TLC/HPTLC預(yù)制板有不同的規(guī)格供應(yīng)。常用的尺寸為20x20，10x20，20x10，或10x10cm。

4、使用的規(guī)格取決于TLC或HPTLC的類別和樣品的數(shù)目。2.2.3TLC/HPTLC板的預(yù)洗及活化一般來說，色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更強(qiáng)的洗脫溶劑的混合物進(jìn)行預(yù)洗。具體操作可通過空白色譜展開來實(shí)現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后,應(yīng)在105°C加熱1小時(shí)進(jìn)行干燥，再在室溫下置放至少2小時(shí)（需采取保護(hù)措施以防止實(shí)驗(yàn)室空氣中的污染物重新附著在其上面，如放置在空的干燥器中）。3.樣品點(diǎn)樣3．1點(diǎn)狀點(diǎn)樣和條帶狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)樣前，TLC/HPTLC板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì)，只有無損傷、清潔的TLC/HPTLC板方可使用

5、。樣品可進(jìn)行點(diǎn)狀或條帶狀點(diǎn)樣。要想獲得最佳的薄層分辨率，必須保證移行方向中的起點(diǎn)要小，常規(guī)的TLC薄層點(diǎn)狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)0.5至5微升，相比之下，HPTLC薄層最大點(diǎn)樣量為1微升。點(diǎn)樣量較大的樣品可使用自動化裝置點(diǎn)樣，噴霧成條帶狀是一種可以點(diǎn)樣量大而同時(shí)又能促成最有效分離的點(diǎn)樣方法。在常規(guī)操作過程中，人工點(diǎn)樣一般使用微量毛細(xì)管（0.5/1/2/3和5?l），點(diǎn)樣時(shí)毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/HPTLC板面，不要損傷薄層，受損的薄層會導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動而在色譜上產(chǎn)生失真的TLC譜帶。人工點(diǎn)樣建議使用Nanomat。

6、它點(diǎn)樣位置精確并安全，使薄層免于受損。用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)干燥Nanomat也可用作單個(gè)量的多次點(diǎn)樣。樣品體積大于5?l，通常用如Linomat或AutomaticTLCSamplerIII的方法用氮?dú)鈬婌F成窄條。若（就是）要求點(diǎn)狀樣品點(diǎn)樣，Linomat和AutomaticTLCSamplerIII應(yīng)將條長度設(shè)定在1至2mm。3.2樣品點(diǎn)樣位置起點(diǎn)的最佳位置如圖2和3所示。起點(diǎn)下緣的最小距離b取決于溶劑量。兩個(gè)起點(diǎn)之間的距離c必須令平行移行的主成份不會相互觸及。點(diǎn)狀點(diǎn)樣時(shí)原點(diǎn)的直徑應(yīng)小于或等于3mm（高效板原點(diǎn)的直徑應(yīng)更?。?條帶的長度d由點(diǎn)樣樣

7、品體積或樣品的種類和相對于板的尺寸點(diǎn)樣的數(shù)目來決定。到板側(cè)邊的距離a必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形（見圖2和3）。圖2：斑狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a=20mm,b=10mm,c=兩起點(diǎn)之間的距離。）圖3：條狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置（a=20mm,b=10mm,c=兩起點(diǎn)之間的距離，d=條的長度）。4.層析4.1展開室4.1.1直立式雙槽展開室具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點(diǎn)。4.1.2水平展開室可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開，這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個(gè)數(shù)比常規(guī)上行展開的薄層板增加一倍。4.1.3自動展開室(A

8、MD)可使用五種溶劑對同一薄層進(jìn)行多次展開，自動控制預(yù)飽和、展開方式、展開距離和干燥條件，分離效率比傳統(tǒng)方式提高三倍（可在80mm之內(nèi)分離40種成分），符合GLP/GMP要求。4