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1、熒光定量PCR技術在臨床檢測中的應用中山大學中山醫(yī)學院生物化學教研室達安基因股份有限公司首席科學家朱振宇醫(yī)學博士、教授、博士生導師Tel：13922430138，020－37656430九十年代中期PCR臨床應用在國內全面展開1998年熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測PCR發(fā)展簡史PCR(PolymeraseChainReaction)1983Cetus公司的KaryMullis于12月16日第一次成功實驗發(fā)明了PCR1985關于PCR的文章首次由KaryMullis及其同事等人在《Science》上發(fā)表198912月《Science》雜志將PCR和它所使用的
2、TaqDNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993KaryMullis，NobelPrizeinChemistry1995PerkinElmer公司研制出熒光定量PCR技術循環(huán)次數(shù)DNA的鏈數(shù)121222243238102101024202201,048,576302301,073,741,82410億PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產量關系PCR循環(huán)PCR特點：高效擴增、忠實復制靈敏度高快捷簡便對樣品純度要求低可以相對定量PCR反應的特點Ct值的意義Ct值與重復性同一樣本在相同條件下同時進行96次擴增FQ-PCRCt值與濃度不同的模板達到熒光域值時的Ct值不同感染性疾病的診斷
3、母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷法醫(yī)學鑒定熒光定量PCR的臨床應用早期診斷病情評估和預后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導新藥驗證一感染性疾病1.病原體含量與病情之間的關系2.病原體含量與用藥之間的關系3.藥物及療法的研究與開發(fā)4.新的病原體分子診斷標準5.新的愈后指標6.傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預測與預防臨床應用臨床應用二腫瘤1.腫瘤標志物：癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細胞因子、受體等2.腫瘤相關基因表達的檢測：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉移基因及轉移抑制基因三遺傳病1.等位基因檢測2.多基因遺傳病的突變檢測3.基因表達異常所致遺傳病檢測熒光定量PCR在病原體檢測中
4、的應用一肝炎病毒定量檢測二性病病原體檢測三結核桿菌及呼吸道病原體檢測四優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關項目檢測臨床應用肝炎病毒定量檢測HBVHCV臨床應用（一）乙型肝炎病毒結構及特點HBsAg：是HBV感染的主要標志HBsAb：保護性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb:非保護性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復制狀態(tài)HBeAg：HBV復制及強感染性的指標HBeAb：有一定的保護作用，預后良好HBVHBV（二）HBV-DNA與“兩對半”1.“兩對半”：機體的免疫反應狀態(tài)；2.“攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學指標不能反應體內病毒
5、復制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質—DNA，是病毒存在和復制的最可靠、最直接的指標。3.血清學指標(－)不能排除HBV感染。HBV（二）HBV-DNA與“兩對半”HBsAg(－)HBV-DNA(＋)HBeAg(－)HBV-DNA(＋)4.也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。5.HBsAb(＋)、HBcAb(＋)、HBeAb(＋)三抗體陽性與HBVDNA2.5×103copy/ml結果解釋。HBV(三)HBV-DNA定量檢測的臨床意義3.HBV-DNA定量與預后a.含量高者急性肝炎患者易慢性化b.癌變的幾率明顯高于含量低者1.HB
6、V-DNA定量與HBV復制水平及傳染性2.HBV-DNA定量與乙肝藥物療效a.專家提出<103copy/ml做為陰性或臨床治愈標準b.HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后)c.拉咪呋啶HBV感染與干擾素治療治療前：a:治療前HBV低水平復制者對干擾素的反應性明顯優(yōu)于高水平復制者。b:治療前HBVDNA含量特別高者大多沒有療效。c:HBsAg轉陰的幾乎都是那些治療前血清HBVDNA含量較低者。HBV感染與干擾素治療治療中：a:病毒復制水平迅速降低者，有望治愈。b:相反，治療期間HBVDNA復制水平下降較慢，或下降幅度較小，或者變化不明顯者，大多是干擾素治療無效。
7、HBV感染與干擾素治療治療后：a:治療結束后，采用PCR定量法檢測，HBVDNA<103copy/ml者，可能不再復發(fā)。b:終止治療后HBVDNA仍保持較低水平者，反跳的可能性較大。ALTMonthsafterStartofTherapy0NormalAlt治療前1234561224HBVDNAHBeAgHBsAgPoorResponsetoIFNTherapyCHRONICHEPATITISB拉咪呋啶：有顯著降低高病毒載量作用，近期療效頗有優(yōu)勢，但是長期使用可導致HBV變異，患者易出現(xiàn)耐受性，而且容易出現(xiàn)停藥后反彈。HBV感染與拉咪呋啶
