熒光定量pcr技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用

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1、熒光定量PCR技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用中山大學(xué)臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)化研究中心主任中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司首席科學(xué)家朱振宇醫(yī)學(xué)博士、教授、博士生導(dǎo)師Tel：13922430138，020－37656430九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測PCR發(fā)展簡史PCR(PolymeraseChainReaction)1983Cetus公司的KaryMullis于12月16日第一次成功實驗發(fā)明了PCR1985關(guān)于PCR的文章首次由KaryMullis及其同事等人在《Science》上發(fā)表198912月《Science》雜志

2、將PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993KaryMullis，NobelPrizeinChemistry1995PerkinElmer公司研制出熒光定量PCR技術(shù)循環(huán)次數(shù)DNA的鏈數(shù)1　2122　2243　23810　210102420　2201,048,576302301,073,741,82410億PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系PCR循環(huán)PCR特點：高效擴(kuò)增、忠實復(fù)制靈敏度高快捷簡便對樣品純度要求低可以相對定量PCR反應(yīng)的特點Ct值的意義Ct值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同時進(jìn)行96次擴(kuò)增FQ-PCRCt值與濃度不同的模板達(dá)

3、到熒光域值時的Ct值不同感染性疾病的診斷母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷法醫(yī)學(xué)鑒定熒光定量PCR的臨床應(yīng)用早期診斷（超早期診斷）病情評估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)新藥驗證一感染性疾病1.病原體含量與病情之間的關(guān)系2.病原體含量與用藥之間的關(guān)系3.藥物及療法的研究與開發(fā)4.新的病原體分子診斷標(biāo)準(zhǔn)5.新的愈后指標(biāo)6.傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測與預(yù)防臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用二腫瘤(HPV-宮頸癌；EBV-鼻咽癌；HP-胃癌)1.腫瘤標(biāo)志物：癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細(xì)胞因子、受體等2.腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基

4、因遺傳?。╝、b-地中海貧血、唐氏綜合癥、性別連鎖遺傳?。?.等位基因檢測2.多基因遺傳病的突變檢測3.基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測熒光定量PCR在病原體檢測中的應(yīng)用一肝炎病毒定量檢測二性病病原體檢測三結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測四優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關(guān)項目檢測臨床應(yīng)用肝炎病毒定量檢測HBVHCV臨床應(yīng)用（一）乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb：保護(hù)性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb:非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)HBeAb：有一

5、定的保護(hù)作用，預(yù)后良好HBVHBV（二）HBV-DNA與“兩對半”1.“兩對半”：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；2.“攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。3.血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染。HBV（二）HBV-DNA與“兩對半”HBsAg(－)HBV-DNA(＋)HBeAg(－)HBV-DNA(＋)4.也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。5.HBsAb(＋)、HBcAb(＋)、HBeAb(＋)三抗體陽性與HBVDNA2

6、.5×103copy/ml結(jié)果解釋。HBV(三)　HBV-DNA定量檢測的臨床意義3.HBV-DNA定量與預(yù)后a.含量高者急性肝炎患者易慢性化b.癌變的幾率明顯高于含量低者1.HBV-DNA定量與HBV復(fù)制水平及傳染性2.HBV-DNA定量與乙肝藥物療效a.專家提出<103copy/ml做為陰性或臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)b.HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后)c.拉咪呋啶HBV感染與干擾素治療治療前：a:治療前HBV低水平復(fù)制者對干擾素的反應(yīng)性明顯優(yōu)于高水平復(fù)制者。b:治療前HBVDNA含量特別高者大多沒有療效。c:HBsAg轉(zhuǎn)陰的幾乎都是那些治療前血清HBV

7、DNA含量較低者。HBV感染與干擾素治療治療中：a:病毒復(fù)制水平迅速降低者，有望治愈。b:相反，治療期間HBVDNA復(fù)制水平下降較慢，或下降幅度較小，或者變化不明顯者，大多是干擾素治療無效。HBV感染與干擾素治療治療后：a:治療結(jié)束后，采用PCR定量法檢測，HBVDNA<103copy/ml者，可能不再復(fù)發(fā)。b:終止治療后HBVDNA仍保持較低水平者，反跳的可能性較大。ALTMonthsafterStartofTherapy0NormalAlt治療前1234561224HBVDNAHBeAgHBsAgPoorResponsetoIFNTherapyCHRONI

8、CHEPATITISB拉咪呋啶：有顯著