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《熒光定量pcr技術(shù)在臨床肺結(jié)核防治中的應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、熒光定量PCR技術(shù)在臨床肺結(jié)核防治中的應(yīng)用【摘要】目的建立熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方法，評(píng)估其在肺結(jié)核的臨床診斷和療效評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。方法針對(duì)結(jié)核分枝桿菌保守序列IS6110基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立熒光定量PCR方法。分別以熒光定量PCR、集菌培養(yǎng)和染色鏡檢法檢測(cè)疑似肺結(jié)核和確診病人隨訪的痰標(biāo)本，比較各方法在結(jié)核病診斷以及治療效果評(píng)估中的作用。結(jié)果熒光定量PCR的檢測(cè)靈敏度為4Copies/反應(yīng)，遠(yuǎn)高于抗酸染色法和集菌培養(yǎng)法。熒光定量PCR法與集菌培養(yǎng)法和抗酸染色法對(duì)臨床樣本的檢出率分別為64.29％、35.12％和12.5％。病人治
2、療效果的隨訪檢測(cè)結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量呈持續(xù)減少的趨勢(shì)。結(jié)論熒光定量PCR方法具有快速、敏感和特異性高的特點(diǎn)，可以快速、及時(shí)獲取病人服藥后的治療效果，為醫(yī)生的后續(xù)督導(dǎo)治療提供依據(jù)，具有重要的臨床意義?！娟P(guān)鍵詞】分枝桿菌熒光定量PCR基因診斷療效觀察【Abstract】ObjectiveToevaluatetheprospectofreal-timePCRintheclinicaldiagnosisandefficiencyevaluationoftreatmenttolungtuberculosis.MethodReal-timePCR
3、ePCRduringclinicaltreatmenttothepatientsePCRismoresensitiveandpositiverate(64.29%)inishedobviouslyinthetreatmentfolloePCRhashighsensitivityandspecificityinthedetectionofM.tuberculosis.Themethodcouldfeedbacktheefficiencyandprovidessensibleadvicefortreatmentintime.【Keytubercu
4、losisReal-timePCRGenediagnosisEfficiencyevaluationoftreatment目前結(jié)核病仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。全球現(xiàn)有肺結(jié)核病人2000多萬(wàn)，其中95％在發(fā)展中國(guó)家，我國(guó)是22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核患者居世界第二位，每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)到15萬(wàn)人，給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展[1～3]。結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸確認(rèn)的重要依據(jù)。提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，促進(jìn)早診斷、早治療是有效控制結(jié)核病蔓延的必要措施。目前臨床以集菌培養(yǎng)和染色鏡檢
5、法為主要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段。大量研究表明，傳統(tǒng)方法的檢出率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)，難以滿(mǎn)足臨床需要。熒光定量PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種重要的基因診斷技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好、可定量、污染少、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用[4，5]。本研究建立了熒光定量PCR檢測(cè)臨床結(jié)核分枝桿菌的方法，并對(duì)熒光定量PCR在臨床肺結(jié)核診斷和療效評(píng)估中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方法1.1標(biāo)本1.1.1疑似病人采集2009～2010年5月到深圳市龍崗區(qū)慢性病醫(yī)院診斷與治療患者的痰液標(biāo)本168份，其中男性115份，女性53份，年齡15～60歲。1.1.
6、2確診患者選擇臨床確診肺結(jié)核病人，有低熱、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺結(jié)核表現(xiàn)，X線(xiàn)健康檢查肺部有結(jié)核病灶，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。為確保樣本采集的連貫性，在爭(zhēng)取病人同意隨訪的同時(shí)，選擇暫時(shí)在家休養(yǎng)的就近病人。跟蹤隨訪采集深圳市龍崗區(qū)慢性病醫(yī)院診斷與治療患者漱口后痰液，選取3例活動(dòng)性肺結(jié)核患者，采集病人服藥前1天的晨痰，隨訪中1～7日內(nèi)每天采集1次，后續(xù)間隔2～5天采集1次。1.2儀器Bact/Alert3D全自動(dòng)細(xì)菌快速培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)系統(tǒng)、Heraeus低溫冷凍離心機(jī)Megafuge1.0R、Biospec-miniDNA/RNA/
7、Proteinanalyzer（島津）、7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀（AppliedBiosystems）、凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)UVItec）。1.3抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法操作參考《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。1.4痰液DNA的提取取0.5ml痰標(biāo)本加入2倍樣本體積4％的NaOH，液化10min后15000r/min離心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml滅菌水，充分振蕩混勻，15000r/min離心2min，去上清液，重復(fù)洗滌3次；沉淀中加入50μlDNA提取液（1％NP-40+2％TritonX-100）[4]，充分振蕩混勻
8、，100℃水浴10min；待冷卻至室溫，15000r/min離心5min，取上清液備用。1.5熒光定量PCR方法[7～10]1.5.1引物與探針設(shè)計(jì)針對(duì)IS6110
