熒光定量pcr技術(shù)在臨床肺結(jié)核防治中的應(yīng)用

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1、熒光定量PCR技術(shù)在臨床肺結(jié)核防治中的應(yīng)用【摘要】目的建立熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方法,評(píng)估其在肺結(jié)核的臨床診斷和療效評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。方法針對(duì)結(jié)核分枝桿菌保守序列IS6110基因設(shè)計(jì)引物和探針,建立熒光定量PCR方法。分別以熒光定量PCR、集菌培養(yǎng)和染色鏡檢法檢測(cè)疑似肺結(jié)核和確診病人隨訪的痰標(biāo)本,比較各方法在結(jié)核病診斷以及治療效果評(píng)估中的作用。結(jié)果熒光定量PCR的檢測(cè)靈敏度為4Copies/反應(yīng),遠(yuǎn)高于抗酸染色法和集菌培養(yǎng)法。熒光定量PCR法與集菌培養(yǎng)法和抗酸染色法對(duì)臨床樣本的檢出率分別為64.29%、35.12%和12.5%。病人治

2、療效果的隨訪檢測(cè)結(jié)果顯示,結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量呈持續(xù)減少的趨勢(shì)。結(jié)論熒光定量PCR方法具有快速、敏感和特異性高的特點(diǎn),可以快速、及時(shí)獲取病人服藥后的治療效果,為醫(yī)生的后續(xù)督導(dǎo)治療提供依據(jù),具有重要的臨床意義?!娟P(guān)鍵詞】分枝桿菌熒光定量PCR基因診斷療效觀察【Abstract】ObjectiveToevaluatetheprospectofreal-timePCRintheclinicaldiagnosisandefficiencyevaluationoftreatmenttolungtuberculosis.MethodReal-timePCR

3、ePCRduringclinicaltreatmenttothepatientsePCRismoresensitiveandpositiverate(64.29%)inishedobviouslyinthetreatmentfolloePCRhashighsensitivityandspecificityinthedetectionofM.tuberculosis.Themethodcouldfeedbacktheefficiencyandprovidessensibleadvicefortreatmentintime.【Keytubercu

4、losisReal-timePCRGenediagnosisEfficiencyevaluationoftreatment目前結(jié)核病仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。全球現(xiàn)有肺結(jié)核病人2000多萬(wàn),其中95%在發(fā)展中國(guó)家,我國(guó)是22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,活動(dòng)性肺結(jié)核患者居世界第二位,每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)到15萬(wàn)人,給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān),嚴(yán)重影響我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展[1~3]。結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸確認(rèn)的重要依據(jù)。提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力,促進(jìn)早診斷、早治療是有效控制結(jié)核病蔓延的必要措施。目前臨床以集菌培養(yǎng)和染色鏡檢

5、法為主要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段。大量研究表明,傳統(tǒng)方法的檢出率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng),難以滿(mǎn)足臨床需要。熒光定量PCR是近年發(fā)展起來(lái)的一種重要的基因診斷技術(shù),具有靈敏度高、特異性好、可定量、污染少、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),得到了廣泛的應(yīng)用[4,5]。本研究建立了熒光定量PCR檢測(cè)臨床結(jié)核分枝桿菌的方法,并對(duì)熒光定量PCR在臨床肺結(jié)核診斷和療效評(píng)估中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1材料與方法1.1標(biāo)本1.1.1疑似病人采集2009~2010年5月到深圳市龍崗區(qū)慢性病醫(yī)院診斷與治療患者的痰液標(biāo)本168份,其中男性115份,女性53份,年齡15~60歲。1.1.

6、2確診患者選擇臨床確診肺結(jié)核病人,有低熱、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺結(jié)核表現(xiàn),X線(xiàn)健康檢查肺部有結(jié)核病灶,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。為確保樣本采集的連貫性,在爭(zhēng)取病人同意隨訪的同時(shí),選擇暫時(shí)在家休養(yǎng)的就近病人。跟蹤隨訪采集深圳市龍崗區(qū)慢性病醫(yī)院診斷與治療患者漱口后痰液,選取3例活動(dòng)性肺結(jié)核患者,采集病人服藥前1天的晨痰,隨訪中1~7日內(nèi)每天采集1次,后續(xù)間隔2~5天采集1次。1.2儀器Bact/Alert3D全自動(dòng)細(xì)菌快速培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)系統(tǒng)、Heraeus低溫冷凍離心機(jī)Megafuge1.0R、Biospec-miniDNA/RNA/

7、Proteinanalyzer(島津)、7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀(AppliedBiosystems)、凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)UVItec)。1.3抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法操作參考《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。1.4痰液DNA的提取取0.5ml痰標(biāo)本加入2倍樣本體積4%的NaOH,液化10min后15000r/min離心5min,去上清液;向沉淀中加入0.5ml滅菌水,充分振蕩混勻,15000r/min離心2min,去上清液,重復(fù)洗滌3次;沉淀中加入50μlDNA提取液(1%NP-40+2%TritonX-100)[4],充分振蕩混勻

8、,100℃水浴10min;待冷卻至室溫,15000r/min離心5min,取上清液備用。1.5熒光定量PCR方法[7~10]1.5.1引物與探針設(shè)計(jì)針對(duì)IS6110

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