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1、高效液相色譜的日常使用和維護高新科技與現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展,促進了以高效液相色譜(HPLC)為代表的復雜樣品的分離分析和分離純化儀器的飛速發(fā)展。HPLC以它定量分析結果準確、分析周期短、分析范圍廣、分析檢測限低等優(yōu)勢,在食品添加劑、藥物成分分析等多領域得到了廣泛的應用。高效液相色譜儀是一種高端檢測儀器,它精密快速,有效準確檢測的同時就要求我們一定要嚴格正確使用儀器,定期科學有效地維護儀器,只有這樣儀器才能長久持續(xù)有效使用。但是從目前實際使用情況看,與高效液相色譜儀的應用及產(chǎn)品技術升級的發(fā)展速度相比,其使用和維護則相對比較滯后,從而造成
2、對儀器的濫用和對耗材不必要的浪費。主要原因是由于對于儀器使用操作者的培訓側重于儀器的初步使用,忽略了儀器的后續(xù)培訓及維護操作學習;其實很多高效液相色譜都是國外進口儀器,英文版本軟件對于大多數(shù)理工科畢業(yè)的儀器操作者也是一個障礙。筆者根據(jù)自己的工作經(jīng)驗,以島津LC-20AT液相色譜儀為例,闡述液相色譜儀在使用時應注意的幾個問題及日常使用后的儀器維護基本事項,并對儀器使用過程中容易遇到的問題進行分析,提出解決方法。1、高效液相色譜儀的組成高效液相色譜儀主要是由輸液系統(tǒng)、進樣器、色譜柱、檢測器和色譜軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。1.1輸液系統(tǒng)輸液系
3、統(tǒng)主要包括溶液貯器、在線脫氣裝置、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置。溶液貯器用于存放符合HPLC要求的流動相。在線脫氣裝置主要功能是流動相在進入柱子前排除氣泡。高效液相色譜柱的填料顆粒較小,通過2~5mm的色譜柱受到的流動阻力很大,因此需要通過高壓輸液泵抽取流動相輸送至色譜柱。高壓泵按輸液性能可分為恒壓泵和恒流泵兩種。按機械結構又可分為液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋注射泵和往復柱塞泵四種,前兩種為恒壓泵,后兩種為恒流泵。恒壓泵可以輸出穩(wěn)定不變的壓力。在一般的分析儀器中,由于系統(tǒng)阻力不變,恒壓亦可達到恒流的效果。但是當系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時,輸入壓
4、力即使不變,流量卻可隨阻力而變化。恒流泵則無論系統(tǒng)阻力如何變化都可保證其流量基本不變。在色譜實際操作中,系統(tǒng)阻力可能隨著運行時間的增加產(chǎn)生微小的改變,因此恒流泵比恒壓泵更優(yōu)越。然而在泵和柱系統(tǒng)所允許的最大壓力下操作時,恒壓泵較為安全方便。梯度洗脫裝置是采用兩種及以上不談性質的溶劑,在分離過程中按照一定的程序設定改變流動相組成的一種洗脫模式。通過流動相極性的變化來調整被分離樣品的選擇因子和保留時間,可以使柱系統(tǒng)具有最佳的選擇性和最大的峰容量。梯度洗脫能夠提高分析成分之間的分離度,縮短分析周期,降低最小檢測限,提高分析精度。對于復雜混合
5、物,特別是保留值相差較大的樣品的分離,梯度洗脫是一種極為有效的分析方法。1.2進樣器進樣系統(tǒng)是將分析樣品送入色譜柱的裝置,分為手動、自動進樣器兩種。手動進樣器配有20~100μL的定量環(huán)。1.3色譜柱色譜柱以液體為流動相,以廣義的固相為固定相來進行分析樣品的分離工作,它是高效液相色譜儀的心臟,柱效能高、選擇性好是對色譜柱的基本要求。色譜柱按照分離模式大致可以分為:正相色譜柱和反相色譜柱。正相色譜柱通常以硅膠(Silica)、胺基團(NH2,APS)和氰基團(CN,CPS)等極性官能團的)非極性化合物的分離,樣品一般能溶于有機溶劑。反
6、相色譜柱通常以硅膠為基礎,表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相為填料;使用極性較強的流動相,通常為水緩沖液與甲醇、已腈等混合物;適用于大多數(shù)有機化合物,生物大、小分子,樣品一般能溶于水。以C8、C18反相色譜柱為代表。1.4檢測器檢測器、泵與色譜柱是組成HPLC的三大關鍵部件。檢測器是將色譜柱分離出的樣品的物理或者化學特性轉換為可以測量的電信號,通過色譜圖記錄下來,由色譜圖中的峰形狀判斷分離效果,依據(jù)標物物質、分析樣品的色譜圖中的出峰時間、峰面積分別對樣品進行定性、定量分析。常用的檢測器主要有紫外吸收檢測器(UVD)、示差折光檢測
7、器(RID)、熒光檢測器(FD)。2、高效液相色譜儀的日常維護2.1高效液相色譜儀器的開機、關機注意事項。一切分析準備工作做好后,依次按順序打開穩(wěn)壓電源、高壓輸液泵、柱溫箱、檢測器,待以上各部件自檢結束后,打開連接儀器的電腦,啟動工作軟件。儀器分析工作結束后,關閉工作軟件,再依次按順序關閉檢測器、柱溫箱、高壓輸液泵。2.2對流動相的要求液相色譜所用的流動相一般為低沸點有機溶劑與水或者緩沖溶液的混合物。為保證液相色譜儀器的正常使用,所有流動相必須是色譜級的,且經(jīng)過過濾雜質、排除氣泡后裝入干凈的流動相貯存瓶中待用。2.2.1流動相的物理
8、性能要求對分析物要有足夠的溶解能力,以利于提高檢驗的靈敏度;流動相的黏度要小,以保證合適的柱降壓;流動相的沸點要低,以利于制備分離時樣品的回收;2.2.2流動相的溫度一般以硅膠為基質的色譜柱最高使用溫度不超過60℃,以低于40℃為宜。