熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果分析問(wèn)題

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1、熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果分析問(wèn)題熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果分析問(wèn)題2010-01-2213：08LineGene實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同結(jié)果分析模式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響目的探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR不同結(jié)果分析模式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。方法用LineGeneFQD33A型熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)本院門診和病房乙肝病人血清HBVDNA77份，分別用最大二階導(dǎo)數(shù)法和樣點(diǎn)擬合法進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種分析方法的總體相關(guān)性較好(r=0.978)o但HBVDNA拷貝數(shù)含量〈105吋,兩種模式的相關(guān)性差(r=0.706),此時(shí)，最大二階導(dǎo)數(shù)法得出的數(shù)值要

2、比樣點(diǎn)擬合法低(t=2.61,P<0.05),且易岀現(xiàn)假陰性結(jié)果。結(jié)論雖然樣點(diǎn)擬合法步驟較多,但其結(jié)果更可靠，因此進(jìn)行結(jié)果分析時(shí)，建議使用樣點(diǎn)擬合法。而且當(dāng)樣本中HBVDNA拷貝數(shù)〈105時(shí)只能使用樣點(diǎn)擬合法進(jìn)行結(jié)果分析。實(shí)時(shí)熒光定量；聚合酶鏈反應(yīng)；質(zhì)量控制7.數(shù)據(jù)分析：(1)相對(duì)定量：使用ACt法計(jì)算目的基因在不同組間的表達(dá)差異。(2)絕對(duì)定量：將樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)目的基因進(jìn)行定量。(3)熔解曲線分析：確定產(chǎn)物特異性。主要實(shí)驗(yàn)步驟：1?設(shè)計(jì)并合成RealtimePCR引物。2.引物溶解后使用Promega的Taq

3、DNA聚合酶進(jìn)行含SG(SYBRGreen)的PCR反應(yīng)優(yōu)化。3.客戶樣品RM抽提。a?實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加lml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿后抽提RNA。b?實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品,每份樣品取1X106~1X107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞,去PBS加lml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。4.RNA質(zhì)量檢測(cè)a.紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，以計(jì)算其濃度并評(píng)估RNA純

4、度。b.使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。5?使用逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。6?制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：進(jìn)行相對(duì)定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測(cè)樣品分別加入到含SG的RealTimePCR反應(yīng)液中(其中TaqBeadTM熱啟動(dòng)聚合酶來(lái)自Promega公司)，進(jìn)行RealTimePCR擴(kuò)增和檢測(cè)。8.檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，以對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)

5、需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測(cè)得值除以管家基因測(cè)得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對(duì)含量。9?提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表。操作程序：1?客戶提供待定量mRNA或DNA的相關(guān)資料，共同探討服務(wù)的可能性和技術(shù)路線。2?簽訂技術(shù)服務(wù)合同，商定服務(wù)收費(fèi)、任務(wù)期限等?？蛻粜枰A(yù)付實(shí)驗(yàn)總費(fèi)用的100%作為實(shí)驗(yàn)預(yù)付款。由客戶提供實(shí)驗(yàn)所需的足夠量的樣品（lOOmg組織塊或107個(gè)細(xì)胞）,木公司不接受您提供的RNA/DNA樣品，除非您有足夠證據(jù)證明所提供的RNA/DNA樣品質(zhì)量。根據(jù)客戶提供

6、的待檢測(cè)基因序列設(shè)計(jì)、合成熒光探針。3?進(jìn)行RNA的抽提、RNA定量、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR反應(yīng)。提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告、定量結(jié)果及彩圖等（我們提供的均為客觀的原始數(shù)據(jù)，不對(duì)這些數(shù)據(jù)的意義做統(tǒng)計(jì)分析）。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)樣本數(shù)量和檢測(cè)基因數(shù)量協(xié)商，工作內(nèi)容包括引物和探針的設(shè)計(jì)、合成，標(biāo)準(zhǔn)品的制備,參照樣品的選擇和實(shí)驗(yàn)條件的摸索等。其后的檢測(cè)費(fèi)用根據(jù)樣品數(shù)的多少，樣品的狀態(tài)（如是組織標(biāo)本還是cDNA）不同再具體協(xié)商確定。1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)

7、的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：DCt值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)吋，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小課差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。2.內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量P

8、CR的影響若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的己知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)