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《實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析.ppt》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線(xiàn)閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析鄧椋爻技術(shù)支持廣州市昊洋貿(mào)易有限公司定量分析絕對(duì)定量相對(duì)定量定量PCR應(yīng)用定性分析SNP分析,基因掃描陰陽(yáng)性判定熔解曲線(xiàn)分析絕對(duì)定量:HowMany–優(yōu)點(diǎn):給出目標(biāo)基因初始模板的絕對(duì)數(shù)量,數(shù)據(jù)容易處理–缺點(diǎn):必須有標(biāo)準(zhǔn)品,做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)–應(yīng)用:病毒拷貝數(shù);轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù);轉(zhuǎn)基因成分百分含量檢測(cè)絕對(duì)定量與相對(duì)定量相對(duì)定量:HowMuch–優(yōu)點(diǎn):需要/不需要標(biāo)準(zhǔn)品;使用廣泛–缺點(diǎn):數(shù)據(jù)理解困難–應(yīng)用:差異表達(dá)分析;芯片評(píng)估14500copies108106102104絕對(duì)定
2、量108106102104T絕對(duì)定量絕對(duì)定量108106102104T絕對(duì)定量105copies/well絕對(duì)定量1/3Blank1/31/31/31.11ng/2ul0.37ng/2ul0.12ng/2ul10.0ng/2ul3.33ng/2ul相對(duì)定量TControlCT=21.3SampleACT=22.8SampleBCT=19.3相對(duì)定量ControlCT=21.3=1.5ng/tube?1SampleACT=22.8=0.5ng/tube?0.33SampleBCT=19.3=6.0
3、ng/tube?4Fold相對(duì)定量相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理?管家基因校準(zhǔn)(NormalizationGene)–得出每個(gè)細(xì)胞中的[目的基因]–目標(biāo)基因vs.管家基因?對(duì)照樣品校準(zhǔn)(CalibratorSample)–得出相對(duì)于某個(gè)樣品的基因表達(dá)量,1Xsample.–處理的vs.未處理的,6hrvs.0hr,病理vs.正常….目標(biāo)基因管家基因處理后處理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator按比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定樣本初始模板濃度至少需要兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)GOI≥referencege
4、ne標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定反應(yīng)擴(kuò)增效率相對(duì)定量——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相對(duì)定量相對(duì)定量:??CT法依據(jù):平均相對(duì)含量%=2–平均ΔΔCT數(shù)據(jù)處理:△C(t)GOI-△C(t)ref=△C(t)△C(t)sample-△C(t)calibrator=△△C(t)好處:不做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)用范圍:擴(kuò)增效率較高,目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率一致并且相互獨(dú)立擴(kuò)增;不做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),高通量檢測(cè)(芯片評(píng)估);不要求很高的精度應(yīng)用實(shí)例-基因表達(dá)分析利用TaqMan技術(shù)研究ERBB2在乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)差異實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程RNA提取RT-qP
5、CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析RNA定量反轉(zhuǎn)錄(RT)設(shè)計(jì)qPCR實(shí)驗(yàn)方法AurumTotalRNAkitiScriptcDNASynthesisKit材料和方法已知在50%的乳腺腫瘤樣本中,ERBB2表達(dá)異常,因此可以作為一個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)選用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因-FAM標(biāo)記的ERBB2探針-VIC標(biāo)記的GAPDH探針標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)粒)構(gòu)造標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)多重PCR反應(yīng)陰性對(duì)照-無(wú)RNA對(duì)照(空白)-無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照(監(jiān)控基因組污染)RNA定性及定量分析Experion?RNAStdSensChip5-500ng/ml100
6、-6,000ntExperion?RNAHighSensChip0.1-5ng/ml100-6,000nt乳癌組織RNA正常乳腺組織RNA5hr.at90°CIntactIntact7hr.at90°CIntact7hr.degradationGAPDHgeneIntact5hr.degradation一步法&兩步法在不同的反應(yīng)管中運(yùn)行RT&PCR1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)加熱滅活反轉(zhuǎn)酶2.PCR反應(yīng)2.PCR反應(yīng)1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)25°C5min42°C30min85°C5min冷卻至4°CiScriptcD
7、NASynthesisKit設(shè)計(jì)qPCR實(shí)驗(yàn)方法定性條件摸索熒光化學(xué)物質(zhì)SYBRGREEN染料Taqman探針定量PCR條件優(yōu)化單雙通道相互驗(yàn)證Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針VIC標(biāo)記看家基因探針動(dòng)態(tài)溫度梯度5-6oCBelow10oCAbovePCR優(yōu)化-溫度確定預(yù)設(shè)退火溫度PCR優(yōu)化-熔解曲線(xiàn)}RealannealingrangePCR優(yōu)化-擴(kuò)增曲線(xiàn)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)95oC,15min94oC,15sec60oC,1minplatereadgotostep3,39moretimes10oC,for
8、everEnd目標(biāo)基因:未知樣品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):標(biāo)準(zhǔn)品梯度監(jiān)控系統(tǒng)故障:陽(yáng)性對(duì)照?監(jiān)控污染:陰性對(duì)照/基因組對(duì)照?校準(zhǔn)生物學(xué)誤差:看家基因?降低其余誤差:重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析-絕對(duì)曲線(xiàn)Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2結(jié)果分析-單雙通道相互驗(yàn)證ERBB2單雙通道相互驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)結(jié)果A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0