動物線粒體基因組全序列測定的研究策略【文獻綜述】

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1、畢業(yè)設(shè)計文獻綜述生物科學動物線粒體基因組全序列測定的研究策略摘要：動物線粒體基因組全序列測定是近年來生物學研究中的一個熱點?？茖W技術(shù)的發(fā)展，對動物線粒體基因組全序列測定的研究策略也產(chǎn)生了深遠的影響。在此對幾種在動物線粒體基因組全序列測定中常用的幾種策略進行了綜述，并對其優(yōu)缺點進行了比較分析。關(guān)鍵詞：線粒體基因組全序列氯化銫密度梯度離心法差速離心法L-PCR前言：線粒體是真核細胞內(nèi)的一種十分重要的細胞器，是細胞進行氧化磷酸化的場所。動物線粒體基因組具有相對較小(約為15～19kb)、結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳和進化速率快等特點[1]。在分子生物學研究方面，其不僅是研究DN

2、A結(jié)構(gòu)與復(fù)制轉(zhuǎn)錄的良好模型，也是研究真核細胞核酸與蛋白質(zhì)合成的模型系統(tǒng)。此外，線粒體基因組作為一種分子標記，廣泛應(yīng)用于動物界不同等級階元系統(tǒng)發(fā)育的研究[2-5]。自1981年4月9日，英國《Nature》雜志公布人類線粒體基因組全序列以來[6]至2008年3月；在不足30年的時間內(nèi)，NCBI中共收錄了后生動物的線粒體基因組全序列1195條，其中，六足動物線粒體基因組全序列81條，研究范圍涉及六足總綱的18個目。動物線粒體基因組全序列的研究方法，通過逐漸改進趨于成熟，本文對其發(fā)展進行了綜述。1　基于物理分離策略的方法在PCR技術(shù)引入線粒體DNA(簡稱mtDNA)分

3、離以前，對于線粒體基因組全序列的測定，主要包括以下2部分內(nèi)容:(1)高純度mtDNA的獲得;(2)mtDNA片段化成適于克隆測序的短DNA片段。1.1　高純度mtDNA的獲得高純度mtDNA的獲得,主要有密度梯度離心法和差速離心法。此外,還有在此基礎(chǔ)上進行局部優(yōu)化的方法,如DNase法、堿變性法和改良的堿變性法等[7-8]。1.1.1　氯化銫密度梯度離心法氯化銫密度梯度離心，不事先制備密度梯度，而是制備6mol/L氯化銫溶液，5待分離的大分子溶解在氯化銫中時，置于高離心場中，氯化銫開始沉降;經(jīng)過幾小時后達到平衡，形成穩(wěn)定的氯化銫密度梯度，大分子混合物按照顆粒的密

4、度分布，在各區(qū)帶中被分開。此法可獲得極高分辨力，特別適用于分離不同類型的核酸[9]。1.1.2　差速離心法差速離心法，又稱為分級離心法，由Tamura和Aotsuka最早建立，由于組織勻漿后的混合液中，不同組分的質(zhì)量不同，利用在離心力場下沉淀它們的離心力不同的原理將組分分離。為了獲得特定的組分，通常需要進行一系列的離心。首先選擇較低的離心速度和較短的離心時間，將不需要的大粒子沉淀去除后，再選擇較高的離心速度和較長的離心時間，將所需的組分沉淀下來，而大多數(shù)更小的粒子則留在上清液中。去除上清液后，再以相同的介質(zhì)將沉淀懸浮后，重復(fù)上述的差速離心；如此反復(fù)多次，直到獲得

5、純度較高的特定組分。獲得純度較低的線粒體后，再通過DNase消化附著在線粒體表面的核DNA，堿變性，高濃度鹽溶液復(fù)性，最終獲得高純度的mtDNA[7,10]。如魯成等利用差速離心法獲得線粒體后，在DNase法和堿變性法基礎(chǔ)上建立的改良后的堿裂解法對家蠶mtDNA進行提取[11]。Saito等利用差速離心法對果蠅屬Drosophila4種果蠅、紅粉甲蟲Triboliumcastaneum、飛蝗Locustamigratoria和家蠶Bombyxmori的線粒體DNA進行了分離[12]。1.2　線粒體DNA片段化上述方法獲得mtDNA通常通過限制性內(nèi)切酶消化或超聲波

6、隨機打斷的方法，片段化為適合克隆測序的短DNA片段。1.2.1　限制性內(nèi)切酶消化選用切割位點較少且分布較均勻的1種或幾種限制性內(nèi)切酶對mtDNA進行完全或不完全消化，形成長度約為數(shù)百堿基不等的短DNA片段，利用脈沖場凝膠電泳將各種長度的DNA片段充分分離，并最終將其克隆至質(zhì)粒載體中進行測序[13-14]。如Crozier和Crozier利用限制性內(nèi)切酶EcoRI，BclI和BglII對蜜蜂Apismellijeru線粒體DNA進行切割后克隆至pUC8或pUC18。此外，使用AccI對mtDNA進行切割，使用DNA聚合酶I對Klenow片段末端進行修飾后，經(jīng)Bcl

7、I或EcoRI切割后克隆至pUC18。除最小的AccI片段(527bp)外，克隆片段幾乎覆蓋了蜜蜂mtDNA的所有區(qū)域。pUC克隆被亞克隆至M13mp8，M13mp18和M13mp19后進行序列測定[15]。1.2.2　超聲波隨機打斷獲得的mtDNA，利用不同強度的超聲波隨機打斷，形成短DNA片段后，克隆至質(zhì)粒載體中進行測序[11]。如魯成等將差速離心法獲得的家蠶mtDNA，經(jīng)超聲波隨機打斷后，回收長度為1.5～3.0kb的DNA片段，并克隆于pUC18載體，挑取300個克隆進行重組質(zhì)粒測序[11]。52　基于常規(guī)PCR技術(shù)的方法參考公布的線粒體基因組研究通用引

8、物[16]，或通過近源物