RNA干擾研究進(jìn)展

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1、RNA干擾研究進(jìn)展謝克亮1王世平1趙長安2(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院本科2001級一部，2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室河南新鄉(xiāng)453003)RNA干擾（RNAinterference，RNAi）現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機制，是指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異地降解該mRNA，從而致使特異性的基因有效封閉的過程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。RNAi現(xiàn)象已在不同種屬的生物體中發(fā)現(xiàn)，下面對RNAi的作用

2、機制、作用特點、生物學(xué)意義和應(yīng)用等的最新研究進(jìn)展作一綜述。1.RNAi的作用機制與特點1.1RNAi發(fā)生的分子機制RNAi的詳細(xì)機制和過程還不十分清楚，目前大致分為以下幾個階段進(jìn)行：①siRNA的形成階段：此階段需要Rde-1,Rde-4和dsRNA特異性的核酸內(nèi)切酶Dicer等共同參與。Rde-1,4編碼的蛋白識別外源dsRNA，引導(dǎo)dsRNA與Dicer結(jié)合，然后，Dicer將dsRNA解旋，再將其裂解為21-25nt大小的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。Dicer定位于胞漿中，但核內(nèi)mRNA剪切修飾后在向核外運輸過程中也存在RNAi現(xiàn)象，可能有其他類似

3、功能的酶發(fā)揮作用?，F(xiàn)認(rèn)為21-25nt大小并在3′端帶有2-3個堿基懸端且5′端磷酸化的siRNA誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)最強。Dicer家族在進(jìn)化上非常保守，有5個組成部分：N-端RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、1個PAZ結(jié)構(gòu)域(Piwi，augonaute，Zwille/pinehead，PAZ)、2個RNaseIII結(jié)構(gòu)域和C端dsRNA結(jié)合基序。Dicer在體內(nèi)一般是以二聚體的形式發(fā)揮作用的，由于不同種族Dicer分子大小不一樣，所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有種族差異[1]。②RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilicencingcomplex，RISC）形成階段：生成的siR

4、NA和RNAi特異性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶結(jié)合形成RISC，具有序列特異性核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特異地降解與siRNA同源的靶mRNA。③效應(yīng)階段[2]：siRNA引導(dǎo)RISC與同源性的mRNA結(jié)合，在ATP及解旋酶（如qde-3，mut-6，mut-14）的作用下使siRNA鏈解離，并使RISC由250kD大小的前體形式變成約100kD左右活性形式，同時解旋酶催化同源mRNA與siRNA的正義鏈相互交換，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成的雙鏈區(qū)的5′起始端下游7-10個核苷酸處切斷mRNA，起到特異的抑制基因表達(dá)的效果。④擴(kuò)

5、增階段：該反應(yīng)以siRNA中的一條鏈為引物，以靶mRNA為摸板，在RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下，擴(kuò)增靶mRNA，產(chǎn)生新的二級siRNA，而這些siRNA又能繼續(xù)反作用于靶mRNA。RdRP不僅能增加siRNA的拷貝數(shù)，而且能將異常的單鏈RNA轉(zhuǎn)變dsRNA。RdRP還是一個重要的“sensor”，它能識別正常和異常的RNA。轉(zhuǎn)基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的識別下啟動RNAi的反應(yīng)過程[3]。此外，RNAi的擴(kuò)增效應(yīng)還可能存在另外兩種機制：①Dicer將長dsRNA切成初級siRNA，這一放大水平取決于dsRNA的長度；

6、②siRNA在酶的作用下可以多次應(yīng)用，產(chǎn)生進(jìn)一步的放大效應(yīng)。1.2RNAi的特點①高度特異性：有時siRNA一個堿基改變就會大大降低封閉靶基因的效果。Brummelkamp[4]等利用載體表達(dá)的小發(fā)夾RNA（smallhairpinRNA，shRNA）來封閉人MCF-7細(xì)胞的CDH1基因，shRNA上僅一對堿基的突變就不能抑制CDH1基因的表達(dá)。其中siRNA的中央位置堿基位點和3′末端倒數(shù)第二個堿基起了格外重要的作用。②高效率[1]：在細(xì)胞內(nèi)RNAi途徑一旦被啟動，反應(yīng)信號就被放大。在低等動物中靶基因表達(dá)抑制效率大于90%，甚至有人認(rèn)為每個細(xì)胞一份拷貝的dsRNA就可以封閉基因的效果。③高成

7、功率：RNAi已被用于線蟲全基因組的功能分析，其中有50%-80%序列選擇有效，12.9%-27%的基因封閉產(chǎn)生了明顯的異常表型。④種屬時-效性：Irie[5]等人發(fā)現(xiàn)，在低等生物中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺乳動物細(xì)胞中只能維持一段時間，一般注入dsRNA后的2-3天，RNAi的作用最明顯，爾后1-2天內(nèi)，靶mRNA的豐度就能恢復(fù)到注射RNAi之前的水平。這可能是由于RNA依賴的核苷脫氨酶