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1、RNA干擾研究進(jìn)展謝克亮】王世平
2、趙長安2(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院本科2001級一部，2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院牛物化學(xué)教研室河南新鄉(xiāng)453003)RNA干擾(RNAinterference,RNAi)現(xiàn)彖是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制，是指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRXA)在細(xì)胞內(nèi)特界地降解該mRNA,從而致使特界性的基因有效封閉的過程,是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilenci
3、ng,PTGS)oRNAi現(xiàn)象已在不同種屬的生物體中發(fā)現(xiàn),下面對RNAi的作用機(jī)制、作用特點(diǎn)、生物學(xué)意義和應(yīng)用等的授新研究進(jìn)展作一綜述。1.RNAi的作用機(jī)制與特點(diǎn)1.1RNAi發(fā)生的分子機(jī)制RXAi的詳細(xì)機(jī)制和過程還不十分清楚，目前大致分為以下兒個(gè)階段進(jìn)行：①siRA的形成階段：此階段需要Rde-l,Rde-4和dsRNA特異性的核酸內(nèi)切酶Dicer等共同參與。Rde-1,4編碼的蛋白識別外源dsRNA,引導(dǎo)dsRNA與Dicer結(jié)合,然后,Dicer將dsRNA解旋，再將其裂解為21-25nt大小的小干擾RNA
4、(smallinterferingRNA,siRNA)oDicer定位于胞漿中，但核內(nèi)mRNA剪切修飾后在向核外運(yùn)輸過程中也存在RNAi現(xiàn)象，可能有其他類似功能的酶發(fā)揮作用?，F(xiàn)認(rèn)為21-25nt人小并在3,端帶有2-3個(gè)堿基懸端且5’端磷酸化的siRNA誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)最強(qiáng)。Dicer家族在進(jìn)化上非常保守，有5個(gè)組成部分：N-端RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、1個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域(Piwi,augonaute,Zwille/pinehead,PAZ)>2個(gè)RNase!TT結(jié)構(gòu)域和C端dsRNA結(jié)合基序。Dicer在體內(nèi)一般是以二聚
5、體的形式發(fā)揮作用的，由于不同種族Dicer分子大小不一樣,所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有種族差異⑴。②RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilicencingcomplex,RISC)形成階段：生成的siRNA和RNAi特異性酶如AGO-2、MUT-7、RED-l、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶結(jié)合形成RISC,具冇序列特界性核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特界地降解打siRNA同源的靶mRNA。③效應(yīng)階段汽siRNA引導(dǎo)RISC與同源性的mRNA結(jié)合，在ATP及解旋酣(如qde-3,
6、mut-6,mut-14)的作用下使siRNA鏈解離，并使RISC由250kD大小的前體形式變成約lOOkD左右活性形式，同時(shí)解旋酶催化同源mRNA與siRXA的正義鏈相互交換，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成的雙鏈區(qū)的5'起始端下游7-10個(gè)核廿酸處切斷mRNA,起到特異的抑制基因表達(dá)的效果。④擴(kuò)增階段：該反應(yīng)以siRNA中的一條鏈為引物，以靶mRNA為摸板，在RNA依賴的RNA聚合0?(RNA-dependentRXApolymerase,RdRP)作用卜，擴(kuò)增靶mRNA,產(chǎn)生新的二級siRNA,而這些siRN
7、A又能繼續(xù)反作用于靶mRNA。RdRP不僅能增加siRNA的拷貝數(shù)，而且能將異常的單鏈RNA轉(zhuǎn)變dsRNAoRdRP還是一個(gè)重要的“sensor",它能識別正常和異常的RNAo轉(zhuǎn)基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的識別下啟動RNAi的反應(yīng)過程⑶。此外，RNAi的擴(kuò)增效應(yīng)還町能存在另外兩種機(jī)制：①Dicer將長dsRNA切成初級siRNA,這一放人水平取決于dsRNA的長度；②siRNA在酣的作用F可以多次應(yīng)用，產(chǎn)生進(jìn)一步的放大效應(yīng)。1.2RNAi的特點(diǎn)①高度特異性：有時(shí)siRNA一個(gè)堿基改變就會人大降低封閉靶基因的
8、效果。Brummelkamp"等利用載體表達(dá)的小發(fā)夾RNA(smallhairpinRNA,shRNA)來封閉人MCF-7細(xì)胞的CDII1基因，shRNA上僅一對堿基的突變就不能抑制CDH1基因的表達(dá)。其屮siRNA的中央位置堿基位點(diǎn)和3,末端倒數(shù)笫二個(gè)堿基起了格外重耍的作用。②高效率⑴：在細(xì)胞內(nèi)RNAi途徑一旦被卅動，反應(yīng)信號就被放大。在低等動物中靶基因表達(dá)抑制效率大于90%,甚至有人認(rèn)為每個(gè)細(xì)胞一份拷貝的dsRA就可以封閉基因的效果。③高成功率：RNAi己被用于線蟲全基因組的功能分析，其屮有50%-80%序列選
9、擇有效，12.9%-27%的基因封閉產(chǎn)生了明顯的片常表型。④種屬時(shí)-效性：Irie⑸等人發(fā)現(xiàn)，在低等生物中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺乳動物細(xì)胞中只能維持一段時(shí)間，一般注入dsRXA后的2-3天，RNAi的作川最明顯，爾后1-2犬內(nèi)，靶mRNA的豐度就能恢復(fù)到注射RNAi之前的水平。這町能是由于RNA依賴的核昔脫氨酶脫氨基活性的逐步增高導(dǎo)
