蛋白質(zhì)含量測定方法的比較.doc

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1、蛋白質(zhì)含量測定方法的比較蛋白質(zhì)含量測定方法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）。其中Bradford法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍,比Biuret法靈敏100倍以上。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。這4種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：⑴實(shí)驗(yàn)對測定所要求的靈敏度和精確度；⑵蛋白

2、質(zhì)的性質(zhì)；⑶溶液中存在的干擾物質(zhì)；⑷測定所要花費(fèi)的時(shí)間。1凱氏定氮法1.1原理凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)過程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨,氨又與硫酸作用,變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。1.2特點(diǎn)凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是測定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡單的方法之一，被國際國內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條

3、件為硫酸銅2.50g,硫酸鉀0.10g,濃硫酸4.00mL；硫酸銅的用量為影響消化時(shí)間的主要因素,硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實(shí)驗(yàn),消化時(shí)間僅為12min；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對比,該法所需消化時(shí)間最短,試劑用量減少,可降低實(shí)驗(yàn)成本,也降低了對環(huán)境的污染。凱氏定氮法適用范圍廣泛，測定結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí),試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替?zhèn)鹘y(tǒng)的消化裝置,可同時(shí)測定幾份樣品，節(jié)省時(shí)間,提高了工作效率，適用于批量蛋白質(zhì)的測定,具有準(zhǔn)確、快速、簡便

4、、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。2雙縮脲法(Biuret)2.1原理雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱,放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能夠以1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量。2.2特點(diǎn)雙縮脲法中樣品的取用量對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響,采用0.5g樣品,40mL雙縮

5、脲試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮脲法對不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,不受溫度的影響。可快速測定蛋白質(zhì)含量，試劑單一,方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為1～20mg蛋白質(zhì)。適用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定，常用于谷物蛋白質(zhì)含量測定。3紫外吸收法3.1原理蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),吸收峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外,蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質(zhì)

6、溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。3.2特點(diǎn)最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法，含有核酸的蛋白質(zhì)溶液使用280和260nm的吸收差法較好。蛋白質(zhì)的稀溶液采用215與225nm的吸收差法。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測,因?yàn)榇藭r(shí)只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其絕對值。缺點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)較多,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí),對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和

7、色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差,故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會出現(xiàn)較大的干擾。核酸在紫外區(qū)也有強(qiáng)吸收，但通過校正可以消除。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過校正,測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外,進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí),由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時(shí)的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。4考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)4.1原理Bradford法是根據(jù)蛋白

8、質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的?？捡R斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收波長從465nm變?yōu)?95nm,蛋白質(zhì)在1～1000μg范圍內(nèi),蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。4.2特點(diǎn)考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定,2min左右即達(dá)到平衡,其結(jié)合物室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5～20min之間,顏色的穩(wěn)定性