一株袋鼠源志賀氏菌的分離鑒定

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1、一株袋鼠源志賀氏菌的分離鑒定耿長(zhǎng)國(guó)1,彭廣能1*,何春燕1,劉沙2,石錦江1,馬曉平1(1?四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院臨床獸醫(yī)系，四川雅安625014；2.遼寧省東港市銀河路22號(hào)東港出入境檢驗(yàn)檢疫局)摘要：本實(shí)驗(yàn)室在從事臨床工作中，從一只死亡袋鼠的內(nèi)臟器官中分離得到一株細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察和生化特性鑒定，初步鑒定為志賀氏菌，并且經(jīng)對(duì)小鼠致病性實(shí)驗(yàn)證明該株菌具有強(qiáng)致病性。志賀氏菌(Shigella),是一類革蘭氏陰性、不活動(dòng)、不產(chǎn)生抱子、無莢膜、無鞭毛、多數(shù)有菌毛的桿狀細(xì)菌，可引起人和其他哺乳類動(dòng)物的細(xì)菌性痢疾。根據(jù)其抗原構(gòu)造的不同，可

2、分為四個(gè)種，即稱痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)>福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)^鮑氏志賀氏菌(Sh.boydii)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Sh.sonnei)o該菌為兼性厭氧菌，能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成中等大小，半透明的光滑型菌落。在腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基上形成無色菌落。分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。VP試驗(yàn)陰性，不分解尿素，不形成硫化氫，不能利用枸椽酸鹽作為碳源。宋內(nèi)氏志賀氏菌能遲緩發(fā)酵乳糖(37°C3?4天)。本實(shí)驗(yàn)室于2007年5月從一只病死的袋鼠身上分離得到一株志賀氏菌，現(xiàn)將分離鑒定過程敘述如下：1材料與方法材料立式高壓蒸氣

3、滅菌器、顯微鏡、冰箱、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱。1.1.2培養(yǎng)基血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基。1.1.3生化實(shí)驗(yàn)用試劑腸桿菌科細(xì)菌?；Ｒ?guī)微量鑒定管，購自浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)牛防疫檢驗(yàn)所。1.1.4病料及來源病料來源于四川某野生動(dòng)物園的一只病死的袋鼠。無菌采其心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)和關(guān)節(jié)囊液用于細(xì)菌的分離鑒定。1.2方法1.2.1分離培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，首先用刀片燒烙各病料組織表面，然后于燒烙處切開組織并用接種環(huán)沾取深部組織于血瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，于37°C恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察菌落生長(zhǎng)情況、形態(tài)和顏色

4、。之后挑取血瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落劃線接種于麥康凱、伊紅美藍(lán)、SS瓊脂培養(yǎng)基，于37°C恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況、形態(tài)和顏色。1.2.2形態(tài)學(xué)檢查分別挑取血瓊脂、麥康凱、伊紅美藍(lán)、SS瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。1.2.3牛化特性鑒定糖發(fā)酵及生化反應(yīng)按常規(guī)進(jìn)行⑴。1.2.4致病性將6只健康小鼠隨機(jī)分成兩組，1組每只腹腔注射0.2ml純細(xì)菌培養(yǎng)物，2組每只腹腔注射0.2ml生理鹽水，將兩組分籠隔離飼養(yǎng)，1?2d觀察其發(fā)病死亡情況。2結(jié)果2.1死亡袋鼠臨床癥狀及病理剖檢變化作者簡(jiǎn)介：耿長(zhǎng)國(guó)(1983-)遼寧省丹東鳳城市人，

5、男,滿族，在讀碩士。*通訊作者：彭廣能(1966-)E-mail:pgn.sicau@163.com,男，土家族，在讀博士，碩士生導(dǎo)師。該袋鼠病程約兩周，這一期間臨床癥狀主要表現(xiàn)為體溫升高、食欲不振、咳血、腹瀉和關(guān)節(jié)囊腫大。剖檢變化主要表現(xiàn)為肺臟大面積淤血、四肢關(guān)節(jié)囊腫大，關(guān)節(jié)囊內(nèi)積有大量清亮液體和淋巴結(jié)腫大。2.2分離培養(yǎng)結(jié)果37°C培養(yǎng)18~24h后，接種肺、關(guān)節(jié)囊液和淋巴結(jié)病料的血瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形、微凸、光滑濕潤(rùn)、灰白色、半透明、邊緣整齊的菌落。該株菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基均能生長(zhǎng)，為無色菌落。據(jù)此結(jié)

6、果可初步判斷為志賀氏菌屬。2.3形態(tài)學(xué)觀察分別將在血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)16?18h的新鮮菌落涂片經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，為無芽胞，無莢膜，革蘭氏陰性短桿菌。2.4生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)項(xiàng)目葡萄糖結(jié)果+—乳糖蔗糖一鼠李糖一甘露醇+衛(wèi)矛醇一V—P試驗(yàn)一枸椽酸鹽腺酶明膠硝酸鹽還原+靛基質(zhì)+甲基紅+賴氨酸脫竣酶一鳥氨酸脫竣酶一注：“+”為陽性，“一”為陰性。據(jù)此結(jié)果，該株菌能分解甘露醇，但不能分解乳糖可將該株細(xì)菌判定為福氏志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌［2］。2.5致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果感染組小鼠在注射12h后開始有發(fā)病跡

7、象，并且在18h內(nèi)全部死亡。將小鼠解剖后，各臟器無明顯病變。分別取死亡小白鼠的肺、肝、脾組織接種麥康凱培養(yǎng)基。培養(yǎng)所得菌經(jīng)鑒定與注射用感染細(xì)菌相同。3討論3.1由于各種因素，本實(shí)驗(yàn)室未能對(duì)分離菌株做進(jìn)一步血清學(xué)凝集試驗(yàn)，確定菌群和菌型。同時(shí)也未能對(duì)死亡袋鼠進(jìn)行相關(guān)病毒等其它病源微牛物的分離。但是就該株志賀氏菌對(duì)小鼠的強(qiáng)致病性、袋鼠的臨床癥狀和病理剖檢變化來看，可判定該株志賀氏菌是引起袋鼠敗血癥，最終導(dǎo)致其死亡的重要原因。3.2據(jù)國(guó)內(nèi)綜合資料,志賀氏菌屬在我國(guó)感染性腹瀉病原菌中居首位。人類對(duì)志賀氏菌有很［2］高的易感性。在幼兒可引起急性中毒性菌

8、痢，死亡率甚高。對(duì)野生動(dòng)物的致病性少見報(bào)道，特別是袋鼠，之前國(guó)內(nèi)幾乎沒有關(guān)于袋鼠感染志賀氏菌而死亡的報(bào)道。鑒于此，我們冇必要提高對(duì)袋鼠感染志賀氏菌的重視，提出有效的