煙草遺傳轉(zhuǎn)化實驗

《煙草遺傳轉(zhuǎn)化實驗》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、實驗八植物細胞懸浮培養(yǎng)實驗?zāi)康模簩W習和掌握植物細胞懸浮培養(yǎng)的操作技術(shù)與方法。實驗器材：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)室、高壓滅菌器、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、250mL、500mL三角瓶、鑷子、酒精燈等。配置MS液體培養(yǎng)基（2，4-D2mg/L+1%甘露醇+3%蔗糖，pH5.8）分裝于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。實驗材料：煙草葉片愈傷組織。實驗方法：1.70%乙醇凈化工作臺并擦洗干凈，將所用的材料、工具、培養(yǎng)基等放入工作臺。打開紫外燈和風機，15分鐘后關(guān)閉紫外燈開始方可操作。2.在超凈臺上用無菌鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織，放入150ml三角瓶中并輕輕夾碎,每個三角瓶加入培養(yǎng)基2

2、0-30ml，每瓶接種1-2g愈傷組織，按愈傷組織與液體培養(yǎng)基1∶10的比例，以保證最初培養(yǎng)物中有足夠量的細胞。3.接種后的三角瓶用天平稱取重量并記載，然后置于搖床上，在轉(zhuǎn)速100-120rpm，25℃下培養(yǎng)以及散射光條件下，進行振蕩懸浮培養(yǎng)。4.每周更換新鮮液體培養(yǎng)基兩次，每次更換1/3。每次更換新鮮培養(yǎng)基時稱取重量。5.每個人接種懸浮培養(yǎng)細胞1瓶，觀察并記錄細胞生長情況。6.培養(yǎng)7天后，制作細胞生長曲線：為了解縣浮培養(yǎng)細胞的生長動態(tài)，可用以下方法繪制生長曲線圖：鮮重法：在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的不同時間，取一定體積的懸浮培養(yǎng)物，離心收集后，稱量細胞的鮮重，以鮮重為縱座標，培養(yǎng)時間為橫座標，繪

3、制鮮重增長曲線。?煙草遺傳轉(zhuǎn)化實驗實驗?zāi)康臒煵菔沁z傳轉(zhuǎn)化的模式植物，已經(jīng)建立了一套完善的轉(zhuǎn)化再生體系。本實驗以煙草為實驗材料，了解根癌農(nóng)桿菌介導法的基本原理和一般步驟，掌握遺傳轉(zhuǎn)化的基本操作技術(shù)。實驗要求：掌握根癌農(nóng)桿菌侵染植物獲取轉(zhuǎn)基因材料的方法；理解農(nóng)桿菌介導途徑進行基因轉(zhuǎn)化的機理；了解轉(zhuǎn)基因植物篩選的方法。實驗原理根癌農(nóng)桿菌是一種能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤的細菌，根癌農(nóng)桿菌中誘導植物產(chǎn)生腫瘤的質(zhì)粒，簡稱為Ti質(zhì)粒。野生型農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，含有兩個與致瘤有關(guān)的區(qū)域：一個是T－DNA區(qū)，含致瘤基因；另一個是毒性區(qū)，在T－DNA的切割、轉(zhuǎn)移與整合過程中起作用。用于植物基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)

4、粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建，是將野生Ti質(zhì)粒中的致瘤基因刪除，并在T－DNA區(qū)域內(nèi)插入適當?shù)倪x擇標記和多克隆位點。pBI121載體是常用的植物表達載體，載體的骨架是pUC18，以CaMV35S啟動子驅(qū)動的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTII為卡那霉素（kan）抗性選擇標記基因，含有卡那霉素抗性基因作為篩選基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作為報告基因，轉(zhuǎn)化的獲得的轉(zhuǎn)基因細胞、組織或植株，具有抗卡那霉素的特性，經(jīng)組織化學染色呈藍色。實驗器材搖床、超凈工作臺、小型離心機、冰箱、移液搶、鑷子、手術(shù)刀、酒精燈、棉球、培養(yǎng)皿、三角瓶、濾紙、牛皮紙、牙簽。實驗材料植物材料：煙草無菌苗農(nóng)桿菌與載體：農(nóng)桿菌LBA44

5、04pBI121YEB培養(yǎng)基：牛肉膏(5g/L)、蛋白胨(5g/L)、酵母提取物(1g/L)、蔗糖(5g/L)、MgSO4(0.5g/L)、pH7.0煙草分化培養(yǎng)基：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LIAA煙草生根培養(yǎng)基：MS+0.5mg/LIAA卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，過濾除菌，分裝，－20℃保存。頭孢霉素（cef）母液：300mg/ml，過濾除菌，分裝，－20℃保存。利福平(rif):50mg/ml，過濾除菌，分裝，－20℃保存。實驗步驟1.農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備：1)接菌于5mlYEB液體培養(yǎng)基(Rif50mg/L)中，28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)1～2天；

6、2)取1mL活化的菌液接種于50mlYEB液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6左右。3)將菌液倒入50mL的離心管中，冰浴20分鐘。4)4℃，5000g離心10分鐘，收集菌體。5)用0.15MNaCl/0.1MCaCl2中懸浮細胞。6)5000rpm離心5分鐘，去上清；7)用冰預(yù)冷20mMCaCl2重懸沉淀，如不是馬上使用，加入甘油分裝，液氮速凍后，-70℃保存。2.農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化：1)取200μl感受態(tài)細胞于Eppendorf管；2)加入1μg質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘；3)立即放入液氮中冰凍5分鐘；(-70℃放置10min)4)取出Eppend

7、orf管，立即放入37oC水浴5分鐘；5)加入YEB培養(yǎng)基lml，28oC，150rpm搖床培養(yǎng)2～3小時；6)離心1分鐘，懸浮細胞在100ulYEB培養(yǎng)基中。7)在YEB固體培養(yǎng)基(Kan50mg/L,Rif50mg/L)涂板；8)28oC下暗培養(yǎng)2～3天；9)挑單菌落，提取質(zhì)粒，酶切，電泳檢查。10)取轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)液于1.5ml的離心管中，加15%的無菌甘油，貯存在-70oC長期保存。3.農(nóng)桿菌活化1）挑取攜帶植物表達載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種在3～5ml含50