血清γ球蛋白分離、純化及鑒定綜合實(shí)驗(yàn)建立及探析

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1、血清Y球蛋白分離、純化及鑒定綜合實(shí)驗(yàn)建立及探析【關(guān)鍵詞】綜合實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)Y球蛋白生物化學(xué)是研究生物體內(nèi)化學(xué)分子與化學(xué)反應(yīng)的科學(xué)，從分子水平探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)［1］。生物化學(xué)基本理論的建立、完善和發(fā)展是以實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)［2］。而要完成開發(fā)學(xué)生的潛能，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力，培養(yǎng)大學(xué)生的綜合素質(zhì)這一任務(wù)的重要手段是在開設(shè)的綜合實(shí)驗(yàn)中得以實(shí)現(xiàn)的［3］。我們依據(jù)最新教學(xué)大綱，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件，對(duì)原有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行了重新整合，力爭(zhēng)即有保留又有創(chuàng)新，設(shè)計(jì)了規(guī)模較大的綜合實(shí)驗(yàn)“血清V球蛋白的分離、純化與鑒定”。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)

2、預(yù)試，并經(jīng)過(guò)一年（兩學(xué)期）醫(yī)學(xué)本科學(xué)生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)證明，實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)可靠，便于學(xué)生操作，教學(xué)效果良好。1材料與方法1.1儀器與材料1.1.1儀器KDC40低速離心機(jī)、1.5cmX20cm玻璃層析柱、722可見分光光度計(jì)、DYY2C電泳儀及DYCZ24D型垂直板電泳槽均為國(guó)產(chǎn)。1.1.2試劑材料新鮮豬血清、pH7.0飽和硫酸鐵溶液、0.01mol/LpH7.0PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)、葡聚糖凝膠G25(SephadexG25)、奈氏(Nessler)試劑、20%(W/V)磺基水楊酸溶液、pH8.6離子強(qiáng)度0

3、.06巴比妥緩沖液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS(十二烷基硫酸鈉)考馬斯亮藍(lán)R250、甘氨酸、Tris、BSA(牛血清白蛋白)等除SephadexG25(SWEDEN進(jìn)口分裝)外均為國(guó)產(chǎn)。1.2方法取新鮮血清2ml,加入等量PBS和飽和硫酸鐵溶液，混勻后靜止30min,3000rpm離心lOmin,沉淀物即是Y球蛋白。該步驟可重復(fù)12次，以保證純度。將V球蛋白通過(guò)SephadexG25層析作用，用PBS洗脫，除去蛋白質(zhì)中的小分子鞍鹽，從而達(dá)到Y(jié)球蛋白純化的目的。洗脫下來(lái)的收集液可以用磺基水楊酸檢測(cè)蛋

4、白質(zhì)的存在，用奈氏試劑檢測(cè)是否除凈NH4+,然后把含有V球蛋白的樣品合并收集。把純化的Y球蛋白與正常豬血清樣品進(jìn)行醋酸纖維素膜電泳作對(duì)照驗(yàn)證。把純化的V球蛋白、正常豬血清樣品用雙縮脈試劑顯色后，用分光光度法測(cè)定其含量，并稀釋成加g/mlo把純化的Y球蛋白、正常豬血清及標(biāo)準(zhǔn)蛋白(2mg/ml)分別用含疏基乙醇的樣品緩沖液處理，用12%分離膠進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)[4],作進(jìn)一步對(duì)照驗(yàn)證。2結(jié)果2.1醋酸纖維素膜電泳純化的Y球蛋白樣品為一條帶（V球蛋白位置）；正常豬血清樣品為五條帶（清蛋白、Q1、

5、Q2、B及Y球蛋白）2.2SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳正常豬血清樣品出現(xiàn)十幾條帶，在清蛋白前面出現(xiàn)二條帶且與純化的Y球蛋白樣品出現(xiàn)的二條帶相平行。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為純一條帶且與正常豬血清樣品的清蛋白相平行，而純化的Y球蛋白樣品無(wú)明顯清蛋白，其它蛋白帶與正常豬血清樣品相比較顏色對(duì)應(yīng)變淺。3討論3.1目的原理血清中的丫球蛋白是一類結(jié)構(gòu)相似具有重要免疫功能的多種蛋白質(zhì)，它們的分子量多數(shù)在150KDa左右，基本結(jié)構(gòu)由兩條分子量相同的輕鏈（H鏈23KDa）和兩條分子量相同的重鏈（L鏈55KDa）通過(guò)二硫鍵連接組成。分離、純化與鑒定Y球蛋白

6、的方法很多，從設(shè)計(jì)的生化實(shí)驗(yàn)?zāi)康目紤]，選用硫酸鐵鹽析分離、葡聚糖凝膠純化V球蛋白，不僅保證其相對(duì)純度，節(jié)省時(shí)間，更重要的是保證其完好的生物學(xué)活性。而用醋酸纖維素膜電泳和SDSPAGE,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量化、比較及特性鑒定，是較為經(jīng)濟(jì)、快速且可重復(fù)的方法，尤其是SDSPAGE,已成為許多研究領(lǐng)域廣為應(yīng)用的重要分析技術(shù)。我們把純化的V球蛋白、正常豬血清及標(biāo)準(zhǔn)蛋白用含有蔬基乙醇的樣品緩沖液處理后進(jìn)行SDSPAGE,可使純化的V球蛋白、正常豬血清中的V球蛋白還原成兩條分子量相同的輕鏈和兩條分子量相同的重鏈而出現(xiàn)二條帶，且相互平行

7、；而標(biāo)準(zhǔn)蛋白不含二硫鍵，不能解鏈，故只出現(xiàn)一條帶且與正常豬血清中的清蛋白相平行。至于純化的Y球蛋白樣品除Y球蛋白解鏈為重輕鏈后的其它蛋白在鹽析時(shí)已分離出大部分，經(jīng)高靈敏度的SDSPAGE仍可不同層度的顯現(xiàn)出淺帶。3.2體會(huì)實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)源為豬血清，取材方便易得，同時(shí)節(jié)約了樣品的用量，本實(shí)驗(yàn)只需1份（每1個(gè)小組）2inl血清樣品即可滿足所需；節(jié)省了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的支出；對(duì)環(huán)境無(wú)污染;而標(biāo)準(zhǔn)蛋白采用單一成分為國(guó)產(chǎn)牛白蛋白（67KDa）,價(jià)格低而且電泳成帶清晰整齊，尤其適合教學(xué)。結(jié)構(gòu)安排合理，難易適度，精簡(jiǎn)了教學(xué)時(shí)數(shù)。綜合實(shí)驗(yàn)共用1

8、6學(xué)時(shí)，分二次完成。第一次8學(xué)時(shí)，血清V球蛋白的分離、純化與鑒定（一），完成血清Y球蛋白的分離、純化及醋酸纖維素膜電泳；第二次8學(xué)時(shí)，血清V球蛋白的分離、純化與鑒定（二），完成Y球蛋白、正常豬血清樣品的定量和SDSPAGE,在時(shí)間上至少節(jié)省8學(xué)時(shí)。在學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作上，從刻度細(xì)管，可調(diào)玻璃加液器的使用到微量進(jìn)樣器，可調(diào)式移液器選用；從免疫抗體的分離