血清白球蛋白的分離、純化及鑒定

《血清白球蛋白的分離、純化及鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、血清白蛋白、γ-球蛋白的分離、純化及鑒定分離純化的一般程序選擇材料破碎細(xì)胞提取分離純化分析及鑒定（粗分級，細(xì)分級）（預(yù)處理）實驗?zāi)康耐ㄟ^從血清中分離、純化、鑒定血清白蛋白和γ-球蛋白的實驗，培養(yǎng)學(xué)生綜合應(yīng)用鹽析、離心、色譜、電泳分光等技術(shù)來分離純化特定蛋白質(zhì)的技能。實驗原理1.初分級:血清經(jīng)飽和硫酸銨鹽析后獲得白蛋白粗分離樣品和球蛋白粗分離樣品。2.脫鹽:用凝膠色譜法除去分離樣品中的鹽類。3.細(xì)分級:用離子交換色譜法從白蛋白粗分離樣品中提取純化的白蛋白；從球蛋白粗分離樣品提取純化的γ-球蛋白。4.鑒定:用醋酸纖維薄膜電泳進行

2、鑒定。1.鹽析原理:當(dāng)高濃度鹽存在時，蛋白質(zhì)往往凝聚并析出沉淀。該技術(shù)為“鹽析”。不同的蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽中形成沉淀。在半飽和硫酸銨溶液中，血清球蛋白會沉淀，經(jīng)離心后，可與白蛋白分離開。影響因素：PH、溫度、蛋白質(zhì)純度等。逐漸改變硫酸銨濃度可分段鹽析出不同的蛋白。操作操作一、鹽析－－白蛋白、γ球蛋白的粗分離<1>取0.5ml血清<2>取0.5ml飽和(NH４)２SO４溶液，緩慢滴入，邊加邊搖。<3>混勻后于室溫中放置10分鐘。<4>8000r/min×10min<5>小心吸取上清液，作為純化白蛋白用。<6>沉淀加0.5ml

3、蒸餾水，使之溶解，作為純化γ球蛋白用。2.脫鹽鹽析后的粗分離樣品中含有硫酸銨離子成分，樣品中含有過高的離子濃度會影響離子交換層析的效果，所以在用離子交換層析進行細(xì)分級前需要脫鹽。凝膠色譜法是一個溫和而又快速的脫鹽方法，同時可將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換到用于離子交換層析的低離子強度緩沖液中。凝膠過濾的原理洗脫液中蛋白質(zhì)及鹽分的檢查取96孔板一塊，上四排加20％磺基水楊酸，下三排加BaCl2液。從下端管口取1滴洗脫液，滴于20％磺基水楊酸中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有蛋白質(zhì)析出，開始收集蛋白樣品。從下端管口取1滴洗脫液，滴于BaCl2中，出現(xiàn)白色

4、混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。二、G-25凝膠層析脫鹽（一）葡聚糖凝膠G-25層析柱的制備（二）上樣與洗脫：1、小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上緩沖液面剛好下降到凝膠床表面(注意不要使液面低于凝膠床表面以致空氣進行凝膠床)。2、關(guān)緊下端出口，用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢的加到凝膠床表面上(注意不要將凝膠粒中沖起或破壞凝膠床表面的平整)。3、開下端出口，使樣品進入凝膠床（剛好下降到凝膠床表面），關(guān)閉出口，小心加入適量pH6.5的0.02mol/LNH4Ac緩沖液。4、放開，流速約20滴/分鐘，立即收集并檢測，20％磺基

5、水楊酸檢測到蛋白后收集三管，10滴/管。顏色最深而且無渾濁的管用于下一步操作。5、BaCl2檢測出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。6、平衡再生：繼續(xù)洗脫30ml。7、白蛋白樣品脫鹽。15滴/管，收集三管。3.純化離子交換色譜是蛋白質(zhì)提純中得到最廣泛應(yīng)用的方法之一。它是以離子交換劑為固定相，利用蛋白帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強弱的不同，而將混合物中的不同蛋白進行分離的色譜技術(shù)。原理：離子交換劑具有帶電荷的酸性基團或堿性基團作離子交換基團，通過靜電作用與帶有相反電荷的離子（反離子）結(jié)合。當(dāng)流動相中存在其他相反

6、電荷的離子時，就與結(jié)合在固定相交換基團上的反離子進行交換。陽離子交換劑具有帶負(fù)電荷的酸性基團作為離子交換基團，能吸附流動相中的陽離子。陰離子交換劑具有帶正電荷的堿性基團作為離子交換基團，能吸附流動相中的陰離子。++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-0.02MNH4AC++++++蛋白樣品---------++++++++AC-AC-AC-AC-AC-AC-NH4+NH4+0.06-0.3MNH4AC--得到純化的γ-球蛋白得到純化的白蛋白γ-球蛋白帶正電白蛋白,α、β球蛋白帶負(fù)電陰離子交換劑三、純化（陰離子交換層析

7、）將脫鹽后含球蛋白的溶液加于DEAE纖維陰離子交換柱上，用0.02mol/LNH4Ac緩沖液洗脫，分管收集洗脫液。檢測到蛋白后立即收集三管，10滴/管，編號。（純化的γ-球蛋白）繼續(xù)洗脫30ml將脫鹽后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/LNH4Ac洗脫30ml。（去掉α、β-球蛋白，午餐休息1小時）改用0.3mol/LNH4Ac洗脫，檢測到蛋白后立即收集三管，15滴/管，編號。（純化的白蛋白）再生：0.3mol/LNH4Ac20ml，0.02mol/LNH4Ac40ml四、醋酸纖維素薄膜電泳檢查（1）血清（2）粗分

8、的γ-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）純化的γ-球蛋白液：由于此溶液濃度較低，應(yīng)多次點樣于同一位置（2次），每次點樣時待干后再點。（5）純化的白蛋白液樣品：操作步驟：１．準(zhǔn)備與點樣2.電泳（點樣面朝下，110V1h）３．氨基黑１０B染色2cm粗糙面