血清白球蛋白的分離、純化及鑒定試驗(yàn)用

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1、血清白蛋白、γ-球蛋白的分離、純化及鑒定目的要求(一)掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。(二)了解柱層析技術(shù)。（一）分離純化的意義①?gòu)纳锊牧现蟹蛛x制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要（二）分離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白和一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要

2、求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過(guò)程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。（三）分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個(gè)階段：①材料的選擇和預(yù)處理②破碎細(xì)胞及提取（有時(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）③分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處理。選擇材料破碎細(xì)胞提取分離純化分析及鑒定常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)溶解度鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀分子大小透析、超過(guò)濾密度梯度離心、凝膠過(guò)濾帶電特性電泳、

3、離子交換層析吸附特性吸附層析對(duì)配體分子的親和性依據(jù)性質(zhì)方法用于粗分用于細(xì)分親和層析、金屬螯合層析一、鹽析（中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。鹽析法的優(yōu)點(diǎn)：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡(jiǎn)單、安全。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。鹽析的基本原理蛋白質(zhì)水溶膠的穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域，中和電荷，破壞親水溶膠溶解度鹽濃度Salting-outSalting-in++++++++++++++++等點(diǎn)電時(shí)的蛋白質(zhì)（親水

4、膠體）帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽(yáng)離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）中性鹽的選擇常用的中性鹽：(NH4)2SO41)溶解度大：0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101硫酸銨在0℃時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類2)分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2

5、～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。4)價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。分段鹽析不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出1)清蛋白等電點(diǎn)是4.0，α2球蛋白等電點(diǎn)是5.06，β球蛋白等電點(diǎn)是5.1，γ球蛋白等電點(diǎn)是7.1。2)清蛋白的分子量遠(yuǎn)小于球蛋白色譜法chromatography脫鹽和純化——石油醚（流動(dòng)相M）植物葉子的石油醚萃取液(樣本)碳酸鈣（固定相S）玻璃管（色譜柱）胡

6、蘿卜素、葉黃素和葉綠素A、B連續(xù)色帶（色譜）1906年俄國(guó)植物學(xué)家米哈伊爾.茨維特一．基本概念色譜法：利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、電荷等），使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相叫固定相，另一個(gè)相流過(guò)此固定相叫流動(dòng)相。由于各組分受流動(dòng)相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度，從而使結(jié)構(gòu)上具有微小差異的各組分得到分離的過(guò)程，稱之為色譜法。二．特點(diǎn)1、高效能2、高度選擇性3、高靈敏度4、操作簡(jiǎn)單不足之處：定量精確，但定性較差色譜三、色譜的種類氣相色譜液相色譜氣－液色譜氣－固色譜液－液色譜

7、液－固色譜1、吸附色譜法2、分配色譜法3、離子交換色譜法4、凝膠色譜法5、親和色譜法按原理分類二、脫鹽（凝膠層析法）透析——只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)超過(guò)濾——除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液凝膠層析又叫分子篩層析。具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩：葡聚糖凝膠（Sephadex）型號(hào)：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國(guó)B