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1、功能基因的克隆及其生物信息學(xué)分析摘要：隨著多種生物全基因組序列的獲得，基因組研究正從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)(functionalgenomics)的整體研究。功能基因組學(xué)利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究獲得的大量數(shù)據(jù)與信息評(píng)價(jià)基因功能(包括生化功能、細(xì)胞功能、發(fā)育功能、適應(yīng)功能等)，其主要手段結(jié)合了高通量的大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)方法、統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)[1]，它代表了基因分析的新階段，已成為21世紀(jì)國(guó)際生命科學(xué)研究的前沿。功能基因組學(xué)是利用基因組測(cè)序獲得的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段，通過(guò)
2、在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白的研究轉(zhuǎn)向多個(gè)基因或蛋白同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，是在基因組靜態(tài)的組成序列基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入對(duì)基因組動(dòng)態(tài)的生物學(xué)功能學(xué)研究[2]。如何研究功能基因，也成為我們面臨的一個(gè)課題，本文就克隆和生物信息學(xué)分析在研究功能基因方面的應(yīng)用做一個(gè)簡(jiǎn)要的闡述。關(guān)鍵詞：功能基因、克隆、生物信息學(xué)分析。1.功能基因的克隆1.1圖位克隆方法圖位克隆又稱定位克隆，它是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上確切位置，尋找與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，篩選BCA克隆，通過(guò)染色體步移法逐步逼近目的基因區(qū)域，根據(jù)測(cè)序結(jié)果
3、或用BAC、YAC克隆篩選cDNA表達(dá)文庫(kù)尋找候選基因，得到候選基因后再確定目標(biāo)基因。優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需掌握基因產(chǎn)物的任何信息，從突變體開(kāi)始，逐步找到基因，最后證實(shí)該基因就是造成突變的原因。通過(guò)圖位克隆許多控制質(zhì)量性狀的單基因得以克隆，最近也有報(bào)道某些控制數(shù)量性狀的主效基因（控制蕃茄果實(shí)大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脫落基因克隆[4]以及小麥VRN2基因克隆[5]等）也通過(guò)圖位克隆法獲得。1.2同源序列克隆目的基因首先根據(jù)已知的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，在已知材料中擴(kuò)增到該片段，并經(jīng)克隆測(cè)序驗(yàn)證，利用放射性同位素標(biāo)記或其
4、他非同位素標(biāo)記該P(yáng)CR片段作為探針，與待研究材料的cDNA文庫(kù)雜交，就可以獲得該基因cDNA克隆，利用克隆進(jìn)一步篩選基因組文庫(kù)，挑選陽(yáng)性克隆，亞克隆并測(cè)序，從中就可以篩選到該基因的完整序列。1.3結(jié)合連鎖和連鎖不平衡的分析方法結(jié)合連鎖和連鎖不平衡的分析方法是未知基因克隆研究領(lǐng)域發(fā)展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。與連鎖分析不同,連鎖不平衡分析可以利用自然群體中歷史發(fā)生的重組事件。歷史上發(fā)生的重組使連鎖的標(biāo)記漸漸分布到不同的同源染色體上,這樣就只有相隔很近的標(biāo)記才能不被重組掉,從而形成
5、大小不同的單倍型片段(Haplotypeblock)。這樣經(jīng)過(guò)很多世代的重組,只有相隔很近的基因,才能仍處在相同的原始單倍型片段上,基因間的連鎖不平衡才能依然存在。所以基于連鎖不平衡分析,可以實(shí)現(xiàn)目的基因的精細(xì)定位。林木大多為自由授粉的異交物種,所以連鎖不平衡程度很低,林木基因組中的LD可能會(huì)僅局限于非常小的區(qū)域,這就為目的基因的精細(xì)定位提供了可能,結(jié)合SNP檢測(cè)技術(shù),科學(xué)家甚至可以將效應(yīng)位點(diǎn)直接與單個(gè)的核苷酸突變關(guān)聯(lián)起來(lái),進(jìn)行數(shù)量性狀寡核苷酸(Quantitativetraitnucleotide,QTN)作圖。當(dāng)然除
6、了相隔很近的基因,某些相隔較遠(yuǎn)的基因,由于受相同的選擇壓力,也可能產(chǎn)生連鎖不平衡。但通過(guò)家系分析,首先可以進(jìn)行目的基因的粗略定位,將目的基因首先限定到一個(gè)較小的區(qū)域,只針對(duì)該區(qū)域內(nèi)的SNP進(jìn)行相關(guān)性分析,從而消除非由連鎖引起的連鎖不平衡干擾。隨著林木全基因組測(cè)序的發(fā)展,連鎖圖譜與LD分析相結(jié)合的方法將是在林木中實(shí)現(xiàn)未知基因克隆的最有效的方法[6]。1.4電子克隆近年來(lái)又興起一種新的基因克隆方法--電子克隆，它是近年來(lái)伴隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù)，借助電子
7、計(jì)算機(jī)的巨大運(yùn)算能力，通過(guò)EST或基因組的序列組裝和拼接,利用RT-PCR的方法快速獲得功能基因,具有投入低、速度快、技術(shù)要求低和針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7]。1.4.1利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息首先選擇感興趣的水稻,EST作為查詢探針，搜索水稻dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)，找到部分重疊的EST進(jìn)行拼接，然后再以拼接好的EST重疊群為新的查詢探針，繼續(xù)搜索dbEST庫(kù),直到?jīng)]有新的EST可供拼接為止，最后根據(jù)拼接好的完整序列設(shè)計(jì)PCR引物，通過(guò)RT-PCR的方法獲得目的cDNA克隆并進(jìn)行序列測(cè)定驗(yàn)證[7]。圖1為利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息克隆水稻功能基
8、因的試驗(yàn)流程。圖1利用水稻EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子克隆的策略1.4.2利用基因組信息利用基因組信息資料進(jìn)行電子克隆的最大優(yōu)點(diǎn)就是基因的克隆不受作物發(fā)育時(shí)期或特殊環(huán)境條件的限制:可以用來(lái)源于任何時(shí)期或組織的水稻和其他物種的EST或全長(zhǎng)cDNA序列作為信息探針?biāo)阉魑挥贕enBank或者我國(guó)華大公布的水稻基因組序列:隨后根據(jù)內(nèi)
