乳糖酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

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1、乳糖酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析【摘要】目的：克隆并分析保加利亞德氏乳桿菌中的乳糖酶基因。方法：利用PCR技術(shù)從保加利亞德氏乳桿菌中克隆出乳糖酶基因、測(cè)序并生物信息學(xué)分析。結(jié)果：成功的從保加利亞德氏乳桿菌中克隆出全長為3024bp的乳糖酶基因，利用生物軟件分析，推測(cè)乳糖酶基因共編碼1008個(gè)氨基酸，蛋白分子量為114KDa，等電點(diǎn)為4.9，氨基酸序列中共有9處潛在的糖基化位點(diǎn)。并將此基因與不同的乳糖酶基因進(jìn)行同源性比較。結(jié)論：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。了解該酶的性質(zhì)特征，為進(jìn)一步研究及低成本表達(dá)該酶奠定基礎(chǔ)

2、?！娟P(guān)鍵詞】乳糖酶基因；克??；生物信息學(xué)分析［ABSTRACT］Objective:TocloneandanalyzelactasegenefromLactobacillusdelbrueckiibulgaricus.Methods:ClonedlactasegenefromLactobacillusdelbrueckiibulgaricusadesequencingandbioinformaticsanalysis.Results:Clonedlactasegene(3024bp)successfully.Itedthatthelactaseg

3、eneencode1008aminoacids,olecule114KDa,isoelectricpoint4.9,9potentialglycosylationsitesinaminoacidsequence.Madehomologyparisonaticsanalysisismadebybiologicalanalysissoftaticsanalysis乳及乳制品含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素和多種礦物質(zhì)，還含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人體消化吸收，是人類改善營養(yǎng)、增強(qiáng)體質(zhì)的理想食品［1］。除此之外，在牛乳

4、等制品當(dāng)中還含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物，對(duì)人體有著重要的作用。主要表現(xiàn)在于乳糖能促進(jìn)鈣質(zhì)吸收及整理腸道的功效，特別是乳糖被分解后的半乳糖是嬰兒腦發(fā)育的必需物質(zhì)，與嬰兒大腦的迅速成長有密切關(guān)系。然而，人體卻不能直接利用乳糖，它必須被乳糖酶分解為單糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，世界各國人口都有不同程度的乳糖酶缺乏，東方人乳糖酶缺乏高達(dá)85%［2］，從而導(dǎo)致“乳糖不耐癥”的發(fā)生。乳糖酶(EC3．2．1．23，又名β半乳糖苷酶)能將牛乳中的乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，并具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用［3］。利用該酶生產(chǎn)低乳

5、糖制品或口服酶制劑，能夠有效解決“乳糖不耐癥”問題。乳糖酶廣泛存在于扁桃、桃、杏、蘋果和咖啡豆等植物中，大腸桿菌、乳酸桿菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳動(dòng)物的小腸等器官和皮膚組織中。然而，不同的乳糖酶，其酶學(xué)性質(zhì)相差很大。本研究從保加利亞德氏乳桿菌中成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。了解該酶的性質(zhì)特征，為進(jìn)一步研究及低成本表達(dá)該酶奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株與質(zhì)粒保加利亞德氏乳桿菌購買于廣東省微生物研究所菌種保藏中心；大腸桿菌DH5α由本室保存；pGMTvector購于北京天根生化科技有

6、限公司。1.1.2試劑材料細(xì)菌培養(yǎng)試劑購于Sigma公司；引物由上海生工合成；LADNA聚合酶購于自大連寶生物公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNALadder購于北京天根生化科技有限公司；T4連接酶、瓊脂糖、熒光染料由本室保存。1.2方法1.2.1保加利亞德氏乳桿菌基因組DNA的提取用滅菌雙蒸水溶解干凍管里的保加利亞德氏乳桿菌，并劃平板到MRS固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72h，挑取單個(gè)菌落于MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌（37℃搖床）。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取保加利亞德氏乳桿菌基因組DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳

7、檢測(cè)純度。1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索到保加利亞德氏乳桿菌中乳糖酶基因序列（GenBank序列號(hào)：GI149564）設(shè)計(jì)引物如下：P1：5'5'CGCGGATCCGCGATGAGCAATAAGTTA3'；P2：5'CCGCTCGAGCGGTTATTTTAGTAAAAGGG3'。上述引物由大連寶生物工程有限公司合成(下劃線堿基分別為BamHI和XhoI酶切位點(diǎn))。1.2.3乳糖酶基因的PCR擴(kuò)增與鑒定反應(yīng)總體積為25μL：模板DNA(1μg/μL)3μL，10×buffer2.5μL,Mg2+(25mM)2.0μL,

8、dNTP(2．5mM)2.5μL,引物P1(10pmol／μL)0.4μL,引物P2(10pmol／μL)0.4μL,LADNA聚合酶(