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1、DNA改組及其研究進展周思(生工1101班201124340105)摘要：自1994年首次提出至今，DNA改組已經(jīng)成為定向進化最為有效的方法之一。無論DNA、蛋白質還是生物體的進化，DNA改組都有十分突出的表現(xiàn)。ＤＮＡ改組技術已在新藥物等領域取得了廣泛的應用，極大地推動了現(xiàn)代生物科學和生物技術的發(fā)展。該技術同計算機強大的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)相結合，將會為后基因組學的發(fā)展提供強有力的技術平臺。通過對十余年來DNA改組的發(fā)展作以簡要綜述，為日后相關研究的開展提供理論基礎。關鍵詞：DNA改組，定向進化，基因家族D
2、NAshufflinganditsresearchprogressZHOUSi(BioengineeringClass201101,201124340105)Abstract:DNAshufflinghasbeenoneofthemosteffectivedirectedevolutionmethodssincereportedin1994.DNAshufflingperformedwellintheevolutionofDNA,proteinandorganism.DNAshufflingproc
3、urebroadapplicationinmanyaspects,especiallyinpharmaceuticalproduction,anddrivethedevelopmentofbiologicalsciencesandbiotechnology.Moreover,takingadvantageoftremendousdataanalysispower,DNAshufflingasapostgenomicstechnologyplatformisbeingincreasinglyrecog
4、nized.DevelopmentofDNAshufflinginrecent10yearswassummarizedforresearch.Keywords:DNAshuffling,directedevolution,DNAfamily1前沿DNA改組是由美國的Sremmer于1994年首先提出，經(jīng)后人的不斷創(chuàng)新和改進，現(xiàn)已發(fā)展成為比較完善的技術體系［1-2］。作為一種高通量的突變和篩選技術，不僅可以實現(xiàn)基因序列的點突變，還可以實現(xiàn)其它突變技術不能實現(xiàn)的基因片段插入、缺失、倒轉和整合等，而且可以
5、反復改組，實現(xiàn)突變的優(yōu)勢積累效應［3］?，F(xiàn)階段該技術以無以倫比的優(yōu)越性已發(fā)展成為比較普遍的研究核酸和蛋白質體外定向分子進化的一種強有的技術［4-5］。并以強大的生命力，已在基礎理論研究、醫(yī)藥研究和工業(yè)酶改造等方面取得了令人矚目的成就。2DNA改組技術的基礎研究2.1DNA改組的基本原理DNA改組可分為如下4步：1、以單個基因或一組同源基因為模板,用化學方法[如脫氧核糖核酸酶I酶切或物理方法(如超聲破碎法)將基因切割成一定大小的片段；2、由于這些小片段間具有一定同源性，可互為引物，故而可在不加引物的情
6、況下通過PCR法將小片段組裝成大片段，完成基因的重聚。當產(chǎn)物序列接近目的基因長度時，再加入合適的引物將大片段相連，得到一個重組基因文庫，將此文庫導入合適質粒，構建工程菌文庫；3、選擇合適的篩選方法(如平板篩選法、噬菌體表面展示技術等)，從工程菌文庫中篩選出最佳的重組子；4、將得到的重組子基因，與初始的同源基因些小片段間具有一定同源性，混合在一起，作為第二輪DNA改組的模板，重復上述步驟，直至得到所需的突變基因［6］。2.2DNA改組的特點2.2.1DNA改組技術可在短時間內實現(xiàn)蛋白質分子的定向進化蛋
7、白質分子的自然進化需經(jīng)歷一段漫長歲月，往往長達幾千年甚至幾百萬年。DNA改組技術的誕生使這個過程大大縮短，研究人員并不需要了解蛋白質進化過程的細節(jié)，只需在體外對基因進行隨機誘變，然后從大量突變體中定向篩選出所需性質的突變體，工作效率更高。2.2.2DNA改組技術提高了分子進化的成功率在DNA改組技術誕生前，隨機誘變和定向誘變?yōu)槌Ｓ玫淖儺愂侄巍ｋS機誘變是通過易錯PCR法對目的基因上的堿基進行隨機替換，具有很大盲目性；而定向誘變需先了解目的基因及其所表達蛋白產(chǎn)物的三級結構、蛋白質功能、關鍵氨基酸所在位置
8、等具體信息，若對此了解甚少，則很難采用該法。DNA改組技術是在易錯PCR法基礎上發(fā)展而來，得到的突變基因可和原型母本基因回交，通過多個循環(huán)使有益突變迅速積累，故能顯著提高有益突變的產(chǎn)生頻率［7］。2.2.3DNA改組對篩選技術的要求較高DNA改組后所構建的突變體庫十分龐雜，若要迅速從中獲得有益突變體，必須采用合適的、高靈敏度及高通量的篩選方法。例如，對酶的最適pH和最適溫度進行改良時，需通過測定酶促反應速度的方式(如熒光法和比色法)進行篩選。3DNA改組技術在現(xiàn)代生物
