病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程與原理88536

《病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程與原理88536》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、........word...完美整理精品文檔病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細(xì)胞，常用的手段是將目的基因包裝成病毒來感染細(xì)胞，從而得到表達(dá)滿足實(shí)驗(yàn)需求。1、病毒的種類病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA/miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通siRNA載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮

2、細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。1.1.2特點(diǎn)1）直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合RNAi研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)。2）可以通過簡單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。3）可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4）無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡便。5）可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。1.1.3慢病毒包裝簡要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。2）慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。3）培養(yǎng)48

3、hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。4）病毒的純化和濃縮。5）分裝、-80℃保存。.......專業(yè)資料供學(xué)習(xí)分享下載........word...完美整理精品文檔6）滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報(bào)告。1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂。有近50個(gè)血清型，大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5，通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在高水平表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。1.2.2特點(diǎn)1）幾乎可以感染所有類型

4、的細(xì)胞2）可以獲得復(fù)制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒3）病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以達(dá)到1012PFU/mL，能有效的進(jìn)行增殖。4）腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.5）感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。1.2.3腺病毒包裝簡要流程1）構(gòu)建表達(dá)siRNA/miRNA的腺病毒載體2）采用PacI消化純化的質(zhì)粒。3）消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。4）將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。5）分裝，-80℃保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比較.......專業(yè)資料供學(xué)習(xí)分享下載.

5、.......word...完美整理精品文檔2、構(gòu)建目的基因到載體2.1構(gòu)建手段一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。1）如果原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到載體，酶切，并測序鑒定2）如果沒有匹配的酶切位點(diǎn)，則設(shè)計(jì)帶有特殊接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測序鑒定2.2質(zhì)粒載體2.2.1概念能夠進(jìn)行自主復(fù)制的環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子.......專業(yè)資料供學(xué)習(xí)分享下載.

6、.......word...完美整理精品文檔2.2.2特征質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。通過個(gè)些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，利用選擇培養(yǎng)基來篩選從而不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。3、質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒，以下是質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。3.1大腸桿菌感受態(tài)

7、細(xì)胞的制備1）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。2）取0.4ml菌液轉(zhuǎn)接到40mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2~3h3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰上放置10min4）4℃離心10min（4000r/min）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6）用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細(xì)胞沉淀，立即冰浴30min7）4℃離心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細(xì)胞（冰上