酵母RNA的提取與鑒定.ppt

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1、酵母RNA的提取與鑒定實驗目的掌握稀堿法分離酵母RNA的原理與操作過程。了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。實驗原理由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。苯酚法是實驗室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。實驗原理酵母細胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%~10.0%，而DNA含量

2、較少，僅為0.03%~0.516%,為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原料，其工藝比較簡單。稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時加熱，以改變細胞壁的通透性，使核酸從細胞內(nèi)釋放出來。實驗原理RNA含有核糖、嘌呤堿/嘧啶堿和磷酸各組分。RNA在酸性條件下，

3、即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉變?yōu)榭啡?，后者與地衣酚（3，5-二羥基甲苯）反應呈鮮綠色，該反應需用三氯化鐵或氧化銅作催化劑。本實驗采用的稀堿，既可加速細胞的破裂，又可增大RNA的溶解度。當堿被中和后，可用乙醇將RNA沉淀，此為RNA的粗品。樣品中少量脫氧核糖核酸(DNA)存在對鑒定無干擾，蛋白質(zhì)、粘多糖可干擾鑒定。試劑的配制地衣酚(苔黑酚)—三氯化鐵試劑將100mg苔黑酚溶于100ml濃鹽酸中，再加入100mgFeCl3·6H2O(或等量CuO)。此液需臨用時配制。實驗步驟1、酵母RNA的提取稱5g干酵母粉于150ml三角

4、燒瓶中，加50ml0.2％的NaOH，沸水浴中攪拌提取30min。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性(pH5~6)。離心(4000r／min，15min)，去除沉淀。向上清液中加入30ml95％乙醇，稍攪拌后靜置。待完全沉淀后離心(4000r／min，15min)，去上清液。沉淀加10ml95％乙醇，攪拌后再次離心。沉淀再依次用10ml的無水乙醇、乙醚(×2)洗滌,得RNA粗品。2．RNA的鑒定取沉淀約0.2g，加2ml10％H2SO4→沸水浴中加熱2min→加1.5ml地衣酚試劑→沸水浴中加熱→觀察顏色變化。實驗步驟注意事項稀

5、堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實驗材料。利用等電點控制RNA析出時，應嚴格控制pH。地衣酚反應特異性較差，凡戊糖均有此反應。因此地衣酚實驗不能作為RNA與DNA鑒別的依據(jù)。