酶的競爭性抑制.ppt

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時間:2020-01-18

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1、酶的競爭性抑制制作人:吳秀、魏鳳麟、李慶慧可逆性抑制劑與酶和(或)酶-底物復合物非共價鍵結合1.競爭性抑制作用的抑制劑與底物競爭結合酶的活性中心競爭性抑制作用:有些抑制劑和酶的底物結構相似,可與底物競爭酶的活性中心,從而阻礙酶和底物結合成中間產物。注:由于抑制劑和酶的結合是可逆的,抑制程度取決與抑制劑與酶的相對親和力和與底物濃度的相對比例。;E+SESE+P+IIKiEIS2.非競爭性抑制作用的抑制劑不該變酶對底物的親和力有些抑制劑與酶活性中心外的必需基團結合,不影響酶與底物的結合,酶和底物的結合也不影響酶與抑制劑的結合(底物與抑制劑之間無競爭關系)。酶-抑制劑復合

2、物(ESI)不能進一步釋放出產物。3.反競爭性抑制作用的抑制劑僅與酶-底物復合物結合反競爭性抑制作用:該抑制劑只與酶合底物形成的中間產物(ES)結合,使中間產物的量下降。這樣,即減少從中間產物轉化為產物的量,也同時減少從中間產物解離出游離酶合產物的量。琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制實驗實驗目的1.學習動物的處死與組織勻漿的方法。2.學習離心機的使用方法。3.進一步理解酶的競爭性抑制原理。實驗原理1.競爭性抑制是指分子結構與底物相似的抑制劑可與底物競爭性結合酶的活性中心,抑制酶的活性。2.酶活性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比例。3.草酸與琥珀酸分子

3、結構相似,是琥珀酸脫氧氫酶劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。在體內琥珀酸脫下的2H經(jīng)電子傳遞鏈傳遞,最后與氧結合生成水,并釋放出能量。在體外則可用甲烯蘭(藍色)作為受氫體,甲氫蘭接受琥珀酸脫下的2H而被還原為甲烯白(無色)。在甲烯蘭含量一定的條件下,藍色的消褪快慢速度可指示琥珀酸脫氫酶的活性,因此可根據(jù)藍色消褪的時間來判斷該酶活性被抑制的程度。實驗器材與試劑(一)器材小白鼠手術剪研缽手術鑷子2ml移液管1ml離心管1000ul微量可調式移液器低速離心機(二)試劑1.pH7.4磷酸緩沖液2.0.25%琥珀酸鈉溶液3.0.5%草酸鈉溶液4.0.01%甲烯蘭溶液

4、5.生理鹽水實驗操作:1.肝糜液的制備:處死小鼠取出肝臟,生理鹽水洗凈,剪碎,研至糊狀分批加入少量磷酸緩沖液(共7ml)移至圓底離心管離心約5分鐘(3000rpm)將上清液移至干凈試管中,即為含酶的肝糜液2.取試管5只,標號,按下表操作試劑1號管2號管3號管4號管5號管0.25%琥珀酸鈉液(ml)0.5—0.520.50.5%草酸鈉液(ml)—0.50.50.52蒸餾水(ml)221.5——肝糜液(ml)11111甲烯藍(ml)*0.20.20.20.20.2注*:甲烯藍的量可以根據(jù)肝糜液制備情況進行調整。搖勻,靜置于37攝氏度的水浴中(此后再勿搖動!?。?,注意觀察

5、各管之顏色變化。記錄各管顏色消退的順序和時間,并分析之。若將退色的反應液震蕩,顏色重新變藍,試分析之。注意事項1.肝臟一定要充分研磨至糊狀,以使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液里。2.離心時注意離心管一定要精確平衡,并將重量相等的離心管對稱放置。3.離心結束后拿取離心管時動作要輕柔,不要震蕩離心管,以免肝糜液重新變渾濁。思考題1.為什么反應開始后,反應液必須靜止,不能再搖動?2.本實驗為何選擇肝臟來提取琥珀酸脫氫酶?本實驗成功的關鍵是什么?3.抑制劑還可以選用什么物質?4.利用本實驗數(shù)據(jù),說明酶競爭性抑制的特點是什么?5.本實驗在設計上存在某些缺陷,指出存在的缺陷與改進方

6、案。

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