實(shí)驗(yàn)5-琥珀酸脫氫酶 ALT.ppt

《實(shí)驗(yàn)5-琥珀酸脫氫酶 ALT.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、琥珀酸脫氫酶的作用及其競爭性抑制生物化學(xué)與分子生物學(xué)系陳園園實(shí)驗(yàn)7了解琥珀酸脫氫酶的作用及酶促反應(yīng)中的競爭性抑制作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康母偁幮砸种谱饔靡种苿┖偷孜锏慕Y(jié)構(gòu)相似，能和酶的底物分子競爭與酶的活性中心相結(jié)合，從而阻礙酶與底物結(jié)合形成中間產(chǎn)物。酶活性位點(diǎn)抑制程度取決于抑制劑和底物對酶的相對親和力以及抑制劑和底物濃度比。加大底物濃度可減弱甚至解除抑制作用。實(shí)驗(yàn)原理延胡索酸琥珀酸還原型甲烯藍(lán)(白)琥珀酸脫氫酶甲烯藍(lán)(藍(lán))E+SESE+P琥珀酸丙二酸E+IEI琥珀酸脫氫酶FADFADH2操作步驟1、酶提取液的制備1~1.3g兔肌肉(剪碎)＋海砂少許(1/3匙)+

2、2ml磷酸鹽緩沖液(1/15mol/L)，研磨成糊狀，然后再加10ml磷酸鹽緩沖液(1/15mol/L)混勻。2、紗布過濾（雙層）3、取小試管五只，按書上P40表格加入各試劑。最后加石蠟隔絕空氣，37℃水浴保溫。每間隔10~15min觀察一次結(jié)果，并記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(hào)12345酶有有有有無底物+++++++++++++抑制劑-+++++++-結(jié)果注意事項(xiàng)注意區(qū)分肌肉與筋膜；家兔肌肉必須充分剪碎碾磨，海砂不可加太多；12ml緩沖液要分次加入，不可一次性加入；碾磨器械、紗布要及時(shí)清洗，紗布要洗干凈晾干；滴加試劑時(shí)，一定要看清試劑的名稱和濃度；滴加液體石蠟

3、時(shí)沿著管壁傾斜加入，蓋住液面即可；觀察結(jié)果時(shí)不能振搖試管，避免甲烯白重新氧化變藍(lán)；實(shí)驗(yàn)完成后試管要用皂粉清洗。改良Mohum法測定鼠肝谷-丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性實(shí)驗(yàn)22實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誈PT活性測定的基本原理熟悉GPT活性測定的具體操作方法了解血清GPT活性測定的臨床意義實(shí)驗(yàn)原理GPT2,4-二硝基苯丙氨酸丙酮酸?-酮戊二酸谷氨酸在520nm波長測定其光密度，與已知濃度的丙酮酸溶液比較，即可計(jì)算谷-丙轉(zhuǎn)氨酶的活性丙酮酸二硝基苯（堿性溶液中呈棕色）血清谷-丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位在pH7.4、37℃條件下，每毫升肝勻漿與底物保溫30min后，每生成2.5?g的丙

4、酮酸作為1個(gè)谷-丙轉(zhuǎn)氨酶的活性單位，血清中GPT正常值為2-40U/mL。實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)管法測定酶活性：1、取干燥試管4支，標(biāo)號(hào)測定管對照管標(biāo)準(zhǔn)管空白管2、依次加入試劑，混勻，37℃保溫3、呈色反應(yīng)后，520nm比色測OD值谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位/mL鼠肝勻漿=?U/ml方法一：以空白管調(diào)0，測A測定、A標(biāo)準(zhǔn)、A對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果A測定測定管中生成丙酮酸的質(zhì)量=———×m標(biāo)準(zhǔn)A標(biāo)準(zhǔn)A對照對照管中生成丙酮酸的質(zhì)量=———×m標(biāo)準(zhǔn)A標(biāo)準(zhǔn)30min中生成丙酮酸的質(zhì)量=m測定–m對照A測定-A對照=—————×m標(biāo)準(zhǔn)A標(biāo)準(zhǔn)30min生成丙酮酸的質(zhì)量1活性單位=—————

5、———————·——2.5?gV測定方法二：以空白管調(diào)0，測A'標(biāo)準(zhǔn)以對照管調(diào)0，測A'測定A'測定———×m標(biāo)準(zhǔn)1A'標(biāo)準(zhǔn)活性單位=————————·——(U/ml)2.5?gV測定注意事項(xiàng)保溫溫度和時(shí)間要精確，即酶發(fā)揮催化作用的環(huán)境要一致。2掌握酶活性單位的概念和計(jì)算方法3微量移液器的使用分光光度計(jì)的使用1.打開電源，調(diào)節(jié)旋鈕至需要的波長，預(yù)熱20~30min2.1檔（空白管），T模式調(diào)100%，顯示“Blank”、“100”3.拉桿拉至1.5檔，T模式下調(diào)0%，顯示“0.00”4.換到A模式，拉至2、3、4檔，讀取各個(gè)樣品的吸光度拉桿，1-4檔

6、樣品池讀數(shù)波長毛面光面1、分清光面、毛面。手應(yīng)接觸毛面，光線從光面通過2、用溶液潤洗2-3次，裝至2/3至4/5體積3、粗紙吸水、柔紙擦亮光面比色杯ALT測定的臨床意義用本法測定血ALT正常值為40U/ml以下肝細(xì)胞中ALT最豐富，當(dāng)肝臟疾病致肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT即大量釋放入血液，致使血清中ALT活性增高。測定ALT是檢查肝功能的重要指標(biāo)之一。顯著增高見于各種急性肝炎及藥物中毒性肝細(xì)胞壞死；中等程度增高見于肝癌、肝硬化、慢性肝炎；輕度增高則見于阻塞性黃疸及膽道炎等疾病。飲酒、油膩飲食、過勞等因素也會(huì)導(dǎo)致ALT短暫增高