胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)實驗.doc

《胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)實驗.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。

1、胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)實驗云南大學生命科學學院本科教學實驗教學中心細胞工程實驗實驗報告摘耍：以胡蘿卜為實驗材料，利用直根形成層為外植體誘導出愈傷組織，探討了不同激素比例對胡蘿卜愈傷組織誘導的影響，然后在誘導后的愈傷組織多次繼代培養(yǎng)獲得生長旺盛的分化組織，接著進行再分化，在胡蘿卜培養(yǎng)過程中掌握誘導培養(yǎng)技術還冇細胞培養(yǎng)所要求的無菌技術。關鍵字：胡蘿卜；愈傷組織；繼代培養(yǎng)；再分化；組織培養(yǎng)胡蘿HDaucuscarotaL）為傘形科兩年生草本植物，因其營養(yǎng)豐富、又具藥用價值，且耐運輸、易栽培、病蟲害少和耐貯藏，而成為人們常食蔬菜。同時又作為生物技術研究的理想材料，因此建立一個高效的、實用的組織培養(yǎng)

2、快速繁殖體系則是研究植物遺傳轉化的基礎。本文對胡蘿卜愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基進行探討，研究了激素對胡蘿卜愈傷組織誘導的影響，為其高效生產次生代謝產物Q■胡蘿卜素、B■胡蘿卜素以及將來組織培養(yǎng)的工廠化【1】和分子生物學研究打下基礎。1?材料和方法1.1材料來源：胡蘿卜根，長10~20cm,直徑lcm以上。1.2方法：1.2.1愈傷組織的誘導培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基的配制：MS+2,4?D2mg/L+KT0.5mg/L+3%(30g/L)白砂糖+0.95%(9.5g/L)瓊脂，pH5.8（2）胡蘿卜的選材、修剪和清洗：選擇新鮮較粗的蘿卜，先用自來水沖洗，再2%洗滌劑浸泡20分鐘，清水沖洗（注意材料損傷

3、）（3）對材料進行滅菌：在超凈工作臺上用75%乙醇30-60S；0.1%升汞8?10分鐘；無菌水沖洗次；（4）無菌修剪：用解剖刀進一步去除兩端1cm,將屮斷切成0.5cm厚的薄圓片，然后再2切去外壁2-3mm厚的皮，選取中間的部分移至無菌的部分，用刀通過形成層切成lcm的小塊；（5）接種：無菌操作將處理好的材料接種于培養(yǎng)基上，2?3個材料/瓶（6）培養(yǎng)及觀察記錄：25°C,光照培養(yǎng)，定期觀察污染情況，生長狀況1.2.2繼代培養(yǎng)從培養(yǎng)瓶中取出愈傷組織，置于無菌培養(yǎng)1111內，用解剖刀將愈傷組織壞死部分剔除并將愈傷組織切成黃豆大小顆粒，放在無激素的新鮮培養(yǎng)基表面，用銀子輕輕壓實，每個培養(yǎng)瓶接種

4、2~3個切塊。用記號筆標注操作者、組別和日期。（3~4周后在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1次）1.2.3愈傷組織再分化的誘導（1）培養(yǎng)基：MS+2,4-D0.5mg/L+KT0.2mg/L（2）從培養(yǎng)瓶中取出愈傷組織，置于無菌培養(yǎng)皿內，用解剖刀將愈傷組織壞死部分剔除并將愈傷組織切成黃豆大小顆粒，放在培養(yǎng)基表面,用躡子輕輕壓實，每個培養(yǎng)瓶接種2~3個切塊。用記號筆標注操作者、組別和口期。適當條件下培養(yǎng)「3周。2.結果2.1愈傷組織的誘導培養(yǎng)結果如下圖，通過觀察，看thMl和M2均被污染長出菌，M3水清化，M4和M5褐化，均沒有成功誘導愈傷組織形成，比較于小組其他同學的培養(yǎng)情況統(tǒng)計于下表：Table2

5、小組誘導愈傷組織形成情況統(tǒng)計后得到小組全部都是沒有成功誘導愈傷組織形成，實驗失敗，誘導率為0。2.2繼代培養(yǎng)結果因誘導愈傷組織培養(yǎng)失敗，所以向老師取來的成功的愈傷組織繼代培養(yǎng)，結果如下圖由圖片看出來初次繼代培養(yǎng)結果良好，愈傷組織繼續(xù)分化，二次繼代培養(yǎng)結果在形態(tài)上已經變大且在組織外層透亮說明生長良好；2.3愈傷組織再分化的誘導再分化的結果待觀察3.討論3.1對于小組內誘導愈傷組織形成的培養(yǎng)結果全部失敗，進行詳細的分析，分為以下幾點3.1.1大部分被微生物感染，培養(yǎng)基內長出大面積菌落，仔細觀察有生出霉菌占大部分，有白色霉菌的抱子絲，還有淡黃色霉菌，還有粘稠的細菌菌落，分析原因有以下幾點（1）首

6、先材料來源帶來的污染，材料來源不是無菌植株培養(yǎng)出來的，而是一般市售的胡蘿卜，所帶有的微生物大部分可能在消毒過程已殺死,但是在外表皮冇細縫沾冇的微生物未被清除，在切材料吋被外層微生物污染，還有因在多次清洗消毒過程會造成材料損傷，給內部材料造成影響;（2）培養(yǎng)瓶封口塑料蓋用久了容易老化，密封性差造成的污染，但我們后面發(fā)現(xiàn)更大可能是蓋子沒有旋緊，因為蓋子是塑料的蓋上以后很容易蓋歪了然后旋不動，就以為是蓋緊了其實是沒有旋緊，讓培養(yǎng)過程屮空氣進入造成大面積污染；（3）學生操作過程不注意細節(jié)部分，比如操作者的雙手要完全伸入超凈工作臺，操作物品盡可能挨近工作臺吹風口，在取各種無菌的器材要用滅菌躡子拿取，

7、打開瓶口要蓋子倒放在工作臺酒精燈附件，而不是正扣下去，這一點也是造成污染主耍原因，因蓋子正扌II會使蓋子內部沾到工作臺的微生物；（4）操作因不熟練所以操作步驟繁瑣，耗時過長，使材料或者培養(yǎng)基長時間暴露，因為操作環(huán)境不是完全的無菌，所以操作熟練動作快縮短時間可以減少污染；3.1.2有水清化的現(xiàn)象，是不生長，不死亡,也無愈傷形成3.1.3冇褐化的現(xiàn)象，是不生長，組織塊顏色發(fā)黑，邊緣發(fā)白，大部分是己死亡；3.2對于繼代培養(yǎng)沒有