生化試驗(yàn)設(shè)計(jì).ppt

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1、生化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)人員：趙樂(lè)，王康華，王凱，孔景浩,許瑤，王軒，王碩最熟悉而又最陌生血紅蛋白的分離、純化，鑒定和定量試驗(yàn)報(bào)告單實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果臨床意義實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，掌握自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的步驟與方法；2,血紅蛋白的分離、純化、鑒定和定量的方法；3,熟悉血紅蛋白分離提純的原理。實(shí)驗(yàn)原理——血紅蛋白概況血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要成分，在正常情況下，每個(gè)紅細(xì)胞均含有一定量的血紅蛋白。血紅蛋白是由珠蛋白和亞鐵血紅素組成的結(jié)合蛋白質(zhì)。血紅蛋白除能與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白外，還能與某些物質(zhì)作用形成多

2、種血紅蛋白衍生物。它們具有特定的色澤和吸光譜，在臨床上，可用以診斷某些變性血紅蛋白血癥和血紅蛋白的定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理——基本原理根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、吸附性質(zhì)、親和力、溶解度等等，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)試驗(yàn)原理不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不一樣，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不一樣。凝膠電泳法原理凝膠色譜法原理透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留袋內(nèi)，以達(dá)到清除小分子雜質(zhì)的目的。

3、透析法原理當(dāng)不同蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠的內(nèi)部通道，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入內(nèi)部通道只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。標(biāo)準(zhǔn)比色法原理在一定量的血液中，血紅蛋白經(jīng)少量的鹽酸的作用，使亞鐵血紅素變成高鐵血紅素。呈現(xiàn)較穩(wěn)定的棕色，用水稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)色比較，即可得出每100ml血液中的含量實(shí)驗(yàn)試劑1、0.9%的氯化鈉溶液2、蒸餾水3、有機(jī)溶劑（甲苯）4、磷酸緩沖液5、檸檬酸鈉6、凝膠色譜柱實(shí)驗(yàn)所需用品7、SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)所

4、需用品8、血紅蛋白計(jì)、0.1mol/L鹽酸溶液、載玻片、刺血針實(shí)驗(yàn)步驟——樣品處理a、洗滌紅細(xì)胞：在采血容器中加入適量檸檬酸鈉，取血后，進(jìn)行低速短時(shí)間離心，將離心后的血液靜置片刻，待分層明顯后，用膠頭吸管吸出上層黃色透明血漿，然后用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液洗滌，低速短時(shí)間離心，重復(fù)4-5次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明已洗凈。實(shí)驗(yàn)步驟——樣品處理b、血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟——樣品處理c、離心：將攪拌好的混合液

5、轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10分鐘，試管中的溶液會(huì)分為四層：最上層為無(wú)色透明的甲苯層；中上層為白色薄層固體的脂溶性物質(zhì)的沉淀層；中下層為紅色透明的血紅蛋白的水溶液層；最下層為暗紅色其他雜質(zhì)的沉淀層。實(shí)驗(yàn)步驟——樣品處理d、分離血紅蛋白溶液：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，在分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層紅色透明液體。粗分離取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，pH為7.0，透析12小時(shí)，目的是除去樣品中分子量較

6、小的雜質(zhì)或用于更換樣品中的緩沖液。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。純化a、凝膠色譜柱的制作：①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。（注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。）④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。b、凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇

7、：材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。c、樣品加入與洗脫：①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面

8、平齊，關(guān)閉出口。②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。③樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻