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1、ICS65.020.30B41DB43湖南省地方標準DB43/T1670—2019非洲豬瘟病毒檢測免核酸提取熒光PCR法DetectionofAfricanSwineFeverVirusReal-timePCRwithoutDNAExtractionMethod2019-10-15發(fā)布2019-12-15實施湖南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB43/T1670—2019目次前言………………………………………………………………………………………………………Ⅱ1范圍……………………………………………………………………………………………………12規(guī)范性
2、引用文件………………………………………………………………………………………13術語和定義……………………………………………………………………………………………14主要儀器設備…………………………………………………………………………………………15主要耗材………………………………………………………………………………………………16試劑……………………………………………………………………………………………………27樣品處理………………………………………………………………………………………………28樣品檢測…………………………………………………
3、……………………………………………39結果判定………………………………………………………………………………………………310生物安全要求………………………………………………………………………………………3附錄A（規(guī)范性附錄）試劑的配制…………………………………………………………………4IDB43/T1670—2019前言本標準按GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本標準的某些內容可能涉及專利，本標準發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本標準由湖南省畜牧水產局提出，由湖南省農業(yè)農村廳歸口。本標準起草單位：湖南省動物疫病預防控制中心、
4、湖南國測生物科技有限公司。本標準主要起草人：何世成、王昌建、劉道新、喻正軍、石建、范葉、林源、唐小明、黃建龍。IIDB43/T1670—2019非洲豬瘟病毒檢測免核酸提取熒光PCR法1范圍本標準規(guī)定了免核酸提取檢測非洲豬瘟病毒核酸的熒光PCR方法。本標準適用于我省范圍內開展非洲豬瘟病毒核酸快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保
5、存與運輸技術規(guī)范NY/T1948獸醫(yī)實驗室生物安全要求通則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1非洲豬瘟（AfricanSwinefever，ASF）由非洲豬瘟病毒（AfricanSwinefevervirus，ASFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其發(fā)病率和病死率均可達到100%，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）的法定報告?zhèn)魅静。谖覈鴮儆谝活悇游镆卟 ?.2熒光PCR實時熒光聚合酶鏈式反應（Real-timepolymerasechainreaction）。4主要儀器設備熒光PCR儀；臺式離心機（轉速≥12000r
6、/m）；小型離心機（轉速≥6000r/m）；-20℃冰箱；微量移液器[（0.2～2.5）μL、（1～10）μL、（10～100）μL、（20～200）μL、（100～1000）μL等規(guī)格]；組織勻漿儀；高壓滅菌鍋；分析天平（精度0.01g）；生物安全柜。5主要耗材無DNase/RNase1.5mL離心管；與熒光PCR儀匹配的PCR薄壁管或8聯(lián)排管；與移液器配套的各規(guī)格吸頭。1DB43/T1670—20196試劑6.1引物與探針引物和探針的設計基于ASFVvp72基因序列，序列如下：a)上游引物：5’-GATGATGATTACCTTYGCY
7、TTG-3’，使用濃度為20μmol/L。b)下游引物：5’-CAACTAATATAAAAYTCTCTTGCTCT-3’，使用濃度為20μmol/L。c)探針：5’-FAM-CCACGGGAGGAATAYCAAC-Mgb-3’，使用濃度為10μmol/L。6.2核酸釋放劑核酸釋放劑配制方法見附錄A.1。6.3熒光PCR試劑6.3.1TaqDNA聚合酶，濃度為5U/μL。6.3.2尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶），濃度為2U/μL。6.3.3dNTPs：由等量dATP、dUTP、dGTP、dCTP組成，終濃度為25mmol/L。6.3.42
8、×PCR緩沖液：配制方法見附錄A.2。6.4陰性與陽性對照6.4.1陽性對照：滅活的非洲豬瘟病毒陽性樣品，Ct值≤30，-20℃保存?zhèn)溆谩?.4.2陰性對照：非洲豬瘟病毒核酸陰性樣品，-20℃
