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1、蘇中地區(qū)豬戊型肝炎病毒的檢測及ORF2融合蛋白對SD大鼠的免疫保護性實驗DetectionoftheswineHEVinJiangsuprovinceandthefusionproteinofORF2immuneprotectiveexperimentsofSDrats碩士研究生：郭志導(dǎo)師：徐建生教授教育部創(chuàng)新團隊項目江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目揚州大學(xué)2014年6月中文摘要戊型肝炎∞patitisE，HE)是一種人畜共患疾病，由肝炎病毒科肝炎病毒屬的戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)引起。一般在亞洲和非洲一些衛(wèi)
2、生條件不發(fā)達的發(fā)展中國家和地區(qū)流行，而發(fā)達國家則呈散發(fā)，我國是主要流行國家之一。HEV可以感染多種動物，其中豬是自然界主要宿主，在跨種問感染和傳播中起著重要作用。所以對豬戊型肝炎病毒的研究對于戊型肝炎的防治有著重要的意義。本研究首先應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄．巢式聚合酶鏈法(R1二I】PcR)對當?shù)啬池i場的豬糞便標本和生豬屠宰中心的豬膽汁標本進行HEVRNA的檢測，并對部分陽性標本進行克隆測序及陽性分析，以探討豬戊型肝炎病毒在該地區(qū)的流行特點。結(jié)果顯示采集的90份膽汁標本中，有4份HEV檢測呈陽性，陽性率為4．44％。在140份豬糞便標本中，只有3～
3、4月齡的35份標本中檢出3份HEVRNA陽性，陽性率為8．57％。其余月齡糞便標本中均未檢出HEVRNA陽性。序列分析發(fā)現(xiàn)豬HEV相互之間在ORF2部分區(qū)域(nt6317～6466)的核苷酸序列的同源性為88．00／o～100．0％。與基因I、II、III和Ⅳ型的同源性為78．0～86．0％，81．3％82．7％，78．7％～84．0％，86．0％98．7％。因此豬戊肝病毒在該地區(qū)的存在且該豬源HEV屬于基因Ⅳ型。然后利用Protean軟件對豬戊型肝炎病毒(hepatitisEVkus，HEV)ORF2基因進行分析，選取4段抗原富集區(qū)
4、域，設(shè)計了4對套式RT-PCR引物分別擴增BE，BH，BW，和BZ區(qū)域的基因。然后將擴增得到將目的基因?qū)雙GEX．6P．1表達載體中并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達。結(jié)果顯示只有兩組重組質(zhì)粒pGEX-BH和pGEX—BW成功表達出了大小分別為39ku和48ku的融合蛋白，而其他兩組重組質(zhì)粒pGEX．BE和pGEX—BZ則微量表達或不表達。將重組蛋白經(jīng)變復(fù)性透析純化后，Western-blotting分析表明大小為48ku的融合蛋白可與HEV陽性血清反應(yīng)，表明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。這個結(jié)果證明了豬HEW的天然免疫表位位于a．a(chǎn)．39
5、8～619之間，為HEV結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的篩選及豬戊型肝炎病毒揚州大學(xué)碩士學(xué)位論文2血清學(xué)診斷的研究奠定了基礎(chǔ)。最后根據(jù)相關(guān)文獻報道SD大鼠可以作為戊型肝炎病毒感染的動物模型，所以研究三用融合蛋白GST-BW與弗氏佐劑等量混合后作為免疫原，按照0d、14d、28d的方案和200u∥只的劑量免疫3只SD大鼠。結(jié)果顯示2只大鼠在第3周抗體轉(zhuǎn)陽，另一只大鼠在4周后抗體轉(zhuǎn)陽。免疫結(jié)束后以HEV懸液分別對試驗組和對照組大鼠進行攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組3只母鼠均出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高，并且在攻毒3天后即可在糞便和血清中檢測到HEVRNA，并且持
6、續(xù)排毒2周左右。試驗組3只SD大鼠均未出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶(岫升高現(xiàn)象，僅在1只大鼠的糞便中檢測出短暫排毒現(xiàn)象。然后取1份免疫組的SD大鼠血清(滴度l"．25600)和正常血清分別與HEV懸液混合過夜后感染2組正常SD大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組2只大鼠出現(xiàn)ALT升高和持續(xù)排毒狀況而抗體中和試驗組2只大鼠未檢測出糞便排毒和ALT升高現(xiàn)象。以上結(jié)果表明GST-BW融合蛋白對大鼠具有良好的免疫原性和免疫保護性，對防治動物之間的戊型肝炎病毒的傳播和候選疫苗表位的篩選提供了相關(guān)基礎(chǔ)的研究。關(guān)鍵詞：豬戊型肝炎病毒：基因分析；克隆表達；免疫保護郭忐：蘇中地區(qū)豬
7、戊型肝炎病毒的檢測及ORF2融合蛋白對SD大鼠的免疫保護性實驗3AbstractHepaititsE(HE)isazoonoticdisease，itiscausedbyhepatitisEvirus．HEoccurredOnbreakoutepidemicstageinAsiaandAfricawithpoorsanitationcondition,whereasonsporadicstageindevelopedcountries，ChinaisonoftheHE-epidemiccountryoftheworld．Various
8、animalsaresusceptibletoHE．Swineisorleofthemostimportantintermediatehostsandplayanimportantroleininterspeciestr
