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1、病毒中和抗體檢測1.病毒TCID50檢測TCID50是指組織培養(yǎng)物（細胞）半數(shù)致死劑量。它有幾個性質(zhì)我們必須明白：1）它表示的是計量，不是濃度；2）它是一個單位；3）它的值等于1，實際上問它的值等于多少是一個沒有意義的問題，就像問km的值等于多少一樣，如果非要說出的的值等于多少，那我們只能說它的值在任何情況下都等于1。理解這三個性質(zhì)對于理解TCID50非常重要，但是這三個性質(zhì)經(jīng)常被誤解，所以導致對TCID50的理解出現(xiàn)偏差。首先我們來看一下這個表示法的意思：病毒滴度為108.2TCID50/ml。它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2個TCID50的病毒，這和氯
2、化鈉的濃度為4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5個mol的氯化鈉是一樣的道理。經(jīng)常可以聽到人說我的病毒的TCID50是10x.x。這個說法是不科學的，應該說我這個溶液里含有10x.x個TCID50的病毒或者說我這個溶液的病毒滴度是10xxTCID50/ml。也可以說病毒的TCID50效價是10-x.x。TCID50=10^5.64/0.1ml。即：將病毒懸液作10^5.64稀釋后，接種細胞0.1ml，可以使50%的細胞產(chǎn)生CPE。（將病毒懸液作10^5.64稀釋后，0.1ml中含1個TCID50，作其他一些實驗時（如中和試驗），一般常用100TCID50/0.
3、1ml或者100TCID50/0.05ml）本方法的優(yōu)缺點:①.優(yōu)點:出現(xiàn)陽性結(jié)果時間較短,且較明顯;②.缺點:有時候,在用槍頭吸出細胞生長液時,容易出現(xiàn)污染;使用本方法時的注意事項:①.稀釋病毒時,每做一個病毒稀釋度都需要換槍頭,減少濃度誤差;②.96孔板,每孔接種的細胞量:一般在此種測定病毒滴度的方法下,要將細胞密度適當調(diào)低,至少要比正常傳代時低一些,否則細胞生長速度過快,未到7天則細胞出現(xiàn)死亡,對觀察CPE不利.一般情況下,小塑料瓶(8-9ml液體為正常用量),培養(yǎng)長慢單層后,消化細胞,加入6ml培養(yǎng)液,吹勻,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在該瓶中加入14
4、-16ml即可,如果不放心,可以用顯微鏡看一下,細胞數(shù)過多則補加培養(yǎng)液,少則補加剩余4ml的細胞懸液;維持液,即病毒培養(yǎng)液,配方為:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%雙抗+NaHCO3;②.MEM+3%谷氨酰胺+1%雙抗+NaHCO3;兩種維持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我個人曾經(jīng)做過實驗,在狀態(tài)很好的細胞上接種病毒,分別使用兩種不同的維持液,最終結(jié)果是一樣的,沒有什么不同,所以可以根據(jù)個人需要進行選擇.另外,曾經(jīng)請教過專門做中和實驗的老師,他認為適當?shù)腇BS對細胞有保護作用,而且他說這是國外文獻上的報道.1）細胞準備1.1檢查培養(yǎng)瓶中的單層細
5、胞，以5ml胰酶－EDTA輕微沖洗1.2加入4－5ml胰酶－EDTA以覆蓋單層細胞1.3放平培養(yǎng)瓶，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中孵育10－20min，直到細胞脫落1.4加入5－10ml培養(yǎng)液，洗下細胞后移到離心管中1.5以PBS洗細胞兩次（12000rpm,5min）1.6以D-MEM重懸細胞，并用血球計數(shù)板計數(shù)1.7以D-MEM將將細胞濃度調(diào)整到1×10^5/ml--1.5×10^5/ml1.8在微量培養(yǎng)板的各孔中加入100μl細胞,相當于?×10^4細胞/孔1.9在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)（18－22h），用處于生長相剛達到完全融合的細胞進行病毒的滴定2）
6、病毒制備3）病毒稀釋3.1取凍存的病毒，以病毒生長培養(yǎng)液（VGM）稀釋10倍，即100微升病毒液+900微升稀釋液，共1毫升。（于1.5MLEP管中進行，將混合液充分吹打振蕩，很重要?。?.2做10倍稀釋3.3在另一新1.5MLEP管中加入100μl第一管稀釋病毒液（1/10），按10的比例進行倍比稀釋，再加入900μl稀釋液，將混合液充分吹打振蕩。以此類推共稀釋至10^13倍。此過程中需要使用加樣器和tip頭。使用前用75%乙醇擦拭加樣器，并用紫外線照射20min，確保無菌。使用新高壓的tip頭，外包裝一定在超凈臺（或安全柜中打開）4）?病毒接種：4.1??取細
7、胞培養(yǎng)板，用多道加樣器（又稱排槍）吸去96孔板中的培養(yǎng)液，吸取孵育液或無血清DMEM加在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因為血清能干擾病毒的吸附）。4.2??于各孔中加100ul各不同的病毒稀釋液，每個稀釋度做一列孔，即每個病毒稀釋度做8個平行復孔，根據(jù)觀察的習慣，一般從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度到原液加樣。(病毒稀釋度的選擇10^3—10^12或者10^4—10^13,因為目的基因不同，重組腺病毒滴度差距很大，應該盡量將稀釋度加大，看到有人用的稀釋度是10^6—10^13)4.3??第11列和12列為陰性對照，陰性對照孔中加
8、入100u
