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1、血液病檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一、活化凝血時間測定【實(shí)驗(yàn)原理】同試管法CT測定。試驗(yàn)中加入白陶土-腦磷脂的懸液以充分激活因子Ⅻ和Ⅺ，并為凝血反應(yīng)提供豐富的催化表面，故稱為活化凝血時間（ACT）；還可以避免因接觸激活階段的不同結(jié)果帶來的影響，從而提高了本試驗(yàn)的敏感性和重復(fù)性。【試劑】1．腦磷脂的制備腦磷脂是將兔腦粉中的組織凝血活酶除去參與外源凝血途徑的蛋白部分后所得的磷脂，故又稱部分凝血活酶。取干燥兔腦粉1.2g加25ml丙酮，放置2h后過濾，將此兔腦粉加氯仿25ml，連續(xù)震蕩2h，以濾紙過濾，濾液蒸發(fā)后為淡黃色蠟狀物，刮入玻璃研缽中，加12ml生理
2、鹽水研磨成均勻乳劑，以每安瓶0.25ml分裝。2．4%白掏土懸液白陶土2g加入50ml生理鹽水中，室溫保存，用前搖動。3．4%白陶土-腦磷脂懸液將腦磷脂用巴比妥緩沖液作1：50稀釋后，再加等量4%白陶土懸液混合而成。4οC可保存3天，用時充分混合。4．巴比妥緩沖液巴比妥鈉11.75g、NaCl14.67g、0.1mol/L的HCl430ml，加蒸餾水至2000ml。此緩沖液pH應(yīng)為7.3，否則影響試驗(yàn)穩(wěn)定性?！静僮鞣椒ā?．在含4%白陶土-腦磷脂懸液0.2ml的試管中注入受檢全血0.5，輕輕混勻。2．其余操作同試管法CT測定?！緟⒖贾怠?.70
3、±0.76(1.14～2.05)min?！九R床意義】1．同試管法CT測定，但較其敏感，重復(fù)性也較好，可檢出因子Ⅷ：C小于45%的亞臨床型血友病。2．是監(jiān)測體外循環(huán)肝素用量的良好指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)二、血漿游離血紅蛋白測定（鄰一甲聯(lián)苯胺法）【實(shí)驗(yàn)原理】鄰一甲聯(lián)苯胺在酸性溶液中和過氧化氫與血紅蛋白共同作用生成氧化型聯(lián)苯胺，產(chǎn)生綠色→藍(lán)色→紫色，其顏色的深淺與血漿游離血紅蛋白的含量呈正相關(guān)。【試劑】1．2g/L鄰一甲聯(lián)苯胺溶液稱取鄰一甲聯(lián)苯胺0.2g，溶于冰醋酸60ml，加蒸餾水至100ml,置于棕色瓶內(nèi)于冰箱保存，色變暗應(yīng)重配。2．1%過氧化氫溶液用30
4、%過氧化氫原液新鮮配制。3．10%冰醋酸溶液。取10ml冰醋酸，加蒸餾水至100ml。4．血紅蛋白應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液將血紅蛋白貯存液用生理鹽水稀釋成10mg/100ml備用。5．抗凝試管取0.2ml100U/ml肝素于試管內(nèi)，在80℃以下烘干，每管可抗凝2ml全血?！静僮鞣椒ā?．將抗凝全血分離血漿。2．取試管3支，分別標(biāo)明測定、標(biāo)準(zhǔn)和空白，分別加入血漿、應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液，再向各管中分別加入鄰一甲聯(lián)苯胺溶液及1%過氧化氫溶液各1.0ml，充分混勻，放置10min。3．于上述3支試管內(nèi)分別加入10%冰醋酸溶液10ml混勻，用435nm波長比色，以空白調(diào)“0”，
5、讀各管吸光度。4．計算：測定管吸光度游離Hb(mg/L)=________________________×100標(biāo)準(zhǔn)管吸光度【質(zhì)量控制】1.一切容器均應(yīng)避免血紅蛋白污染，標(biāo)本勿溶血，否則可引起假陽性。2.過氧化氫溶液濃度要準(zhǔn)，新鮮配制。3.聯(lián)苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超過30%，否則均可引起吸光度降低。4.標(biāo)準(zhǔn)液的加入量一定要準(zhǔn)?！緟⒖紖^(qū)間】<40mg/L【臨床意義】血漿游離血紅蛋白含量增加是血管內(nèi)溶血的特征。血漿中血紅蛋白含量超過與血清中結(jié)合珠蛋白的結(jié)合能力時，其含量即可升高。微血管內(nèi)溶血時，血漿游離血紅蛋白含量均明顯升高。PNH為2
6、00～2500mg/L，輸不合血型后為150～5000mg/L。溫抗體型自身免疫性溶血性貧血、鐮狀細(xì)胞貧血及地中海貧血時血漿游離血紅蛋白可輕度或中度增加。血管外溶血則正常。實(shí)驗(yàn)三、血清結(jié)合珠蛋白測定（比色法）【實(shí)驗(yàn)原理】血清結(jié)合珠蛋白（Hp）是肝臟產(chǎn)生的a2糖蛋白，它與游離的血紅蛋白（Hb）具有特殊的親合力，可形成穩(wěn)定的Hb-Hp復(fù)合物，后者在弱酸性（pH4）條件下，具有過氧化物酶的活性，測其活性可間接反映Hp的含量。【試劑】1．乙酸緩沖液0.2mol/L（pH4）稱取乙酸鈉（NaAC·3H2O）2.8g,冰乙酸5.7ml溶解，加蒸餾水至500
7、ml。2．0.1%（V/V）愈創(chuàng)木酚溶液取1ml愈創(chuàng)木酚溶液于500ml乙酸緩沖液中，加蒸餾水至1000ml。3．0.3%過氧化氫溶液臨用前配制。4．0.5g/L高鐵血紅蛋白液?！静僮鞣椒ā?．取靜脈血分離血清，避免溶血。2．取受檢血清0.4ml，與等量高鐵Hb溶液混合。3．取上述混合液0.2ml，加入于已預(yù)溫（25℃）的愈創(chuàng)木酚5ml溶液中，再加入0.5ml0.3%過氧化氫，于25℃水浴內(nèi)作用8min，注意避光。每份標(biāo)本均應(yīng)雙份同時測定。4．用蒸餾水調(diào)“0”點(diǎn)，440nm處讀取吸光度。5．由校正曲線查出受檢血清中Hp含量?！举|(zhì)量控制】1．受檢
8、血清要避免溶血。2．電泳時溫度不能過高，應(yīng)把電泳槽置于冷水中電泳。否則電泳效果差，區(qū)帶不易區(qū)分。3．電泳液應(yīng)經(jīng)常更換，防止因pH及離子強(qiáng)度改變對電泳效
