基因工程載體-噬菌體載體.ppt

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1、2012.09第二節(jié)噬菌體載體2噬菌體載體（phagevectors）一、?噬菌體載體二、單鏈?zhǔn)删w載體三、噬菌粒載體四、柯斯質(zhì)粒載體一、?噬菌體載體噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）（一）噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。T4Bacteriophage71.噬菌體的生物學(xué)特性溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分

2、裂而進(jìn)行復(fù)制。整合了一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為溶源性細(xì)菌。在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體。噬菌體溫和噬菌體，具有溶源生長(zhǎng)周期和溶菌生長(zhǎng)周期烈性噬菌體,只具有溶菌生長(zhǎng)周期分為兩種：（1）溶菌周期：噬菌體的生活周期烈性噬菌體（virulentphage)（2）溶原周期：感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱為溶源化溫和噬菌體（temperatephage)2、噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型：結(jié)構(gòu)：無(wú)尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、線狀體型核酸類型：最常見(jiàn)的是雙鏈線性DNA、雙鏈環(huán)形DNA

3、、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線形DNA、單鏈RNA。3、λ-DNA的物理圖譜λ-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個(gè)12核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘性末端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，稱為cos區(qū)，全長(zhǎng)48.5kb。特點(diǎn)是功能相近的基因在基因組中聚集在一起。λ噬菌體組成特點(diǎn)：雙鏈線狀DNA分子，全長(zhǎng)50kb，含65個(gè)基因，在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點(diǎn)。λ噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長(zhǎng)和溶源性生長(zhǎng)溶菌性生長(zhǎng)（lyticpathway）噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2個(gè)COS位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，

4、合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來(lái)的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。溶源性生長(zhǎng)(lysogenicpathway)噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解。?噬菌體AWBDEFZJattxisNclcroOPQSR結(jié)構(gòu)區(qū)重組區(qū)調(diào)控區(qū)裂解區(qū)cos位點(diǎn)cos位點(diǎn)ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置換型AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS頭部基因尾部基因功能不明區(qū)溶源化重組早期控制阻遏D

5、NA合成溶菌生長(zhǎng)非必須區(qū)段cI基因：溶源過(guò)程控制基因。λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage?cosendsCircularformLinearform（二）λ噬菌體載體的主要類型（1）插入式載體一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。（2）替換型載體（取代型載體）具有成對(duì)

6、的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。（3）凱倫噬菌體載體（2）λ替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段(~20kb)高感染效率(109轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA,比質(zhì)粒高100-倍)e.g.EMBL3,?DASH替換式載體野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等載體，這些載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac5作為

7、選擇標(biāo)記，使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。（3）凱倫噬菌體載體既有插入型；又有替換型在基因工程實(shí)驗(yàn)中的用途十分廣泛承受外源DNA的能力：幾個(gè)kb到23kb（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）（三）體外包裝λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過(guò)體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入E.coli細(xì)胞內(nèi)。這是因?yàn)橐愿腥痉绞綄?dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106~108/μgDNA，而以轉(zhuǎn)染（translatio

8、n）的方式導(dǎo)入的頻率僅為103~105/μgDNA。