基因工程載體.ppt

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1、基因工程常用載體END!THANDSFORYOURCOMING!在大腸桿菌的各種菌株中找到了許多種不同類型的質粒，其中已經(jīng)作了比較洋盡研究的主要有F成粒、R質粒和C。l質位．由于這些成粒的存在，寄主細胞便獲得了各自不同的性狀特征，根據(jù)這些特征來鑒別這三種不同類型的質粒；①F質粒又叫F因子或性質粒（Sexplasmid)。它們能夠使寄主染色淬上的基因和F質粒一道轉移到原先不存在該質粒的受體細胞中去。②R質粒通稱抗藥性因子。它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能夠將此種抗性轉移到缺乏該質粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌索抗性能力。③Col質

2、粒即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。大腸桿菌素是一類可以使不帶有Col質粒的親緣關系密切的細菌菌株致死的蛋白質。大腸桿菌菌株中不同類型的質粒噬菌體λ載體的構建野生型噬菌體λDNA全長約50kb，上有65種限制酶酶切點，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、SnaBⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7種限制酶各有一個切點外，其余都多于2個。有些酶切點在λ增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此，噬菌體λ必須經(jīng)過改造才能用作載體。現(xiàn)在用的λ載體大都除去了某種限制酶的酶切點。因此，作為載體的噬菌體λ都短于野生型。噬菌體λ載體有兩種類型①插入型。由于改

3、建后的噬菌體λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長，插入片段就可越大。②置換型。噬菌體λ的基因組可分為三個區(qū)域，左側區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長約20kb。右側區(qū)內(nèi)包含所有的調控因子、與DNA復制及裂解宿主菌有關的基因，這個區(qū)域約長12kb。中間區(qū)域約長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會影響噬菌體λ裂解生長的能力。置換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。噬菌體λ裂解生長的能力同包裝在頭蛋白中的λDNA的大小有關。當DNA的長度短于野生型的78%或超

4、過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。置換型載體DNA用選定的限制酶完全酶切后，要設法除去中間片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接，包裝成重組噬噬體。這是因為左臂和右臂與中間片段間都有單鏈“粘性末端”，在連接酶作用下可以重新恢復原來的結構，從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍色噬菌斑試驗。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼β半乳糖苷酸的基因。當這種噬菌體感染lac宿主細胞并在含有Xgal(5溴4氯3吲哚βD半乳糖

5、苷)的培養(yǎng)基上生長時，半乳糖苷酸與Xgal反應的產(chǎn)物為不溶性的靛藍染料。因此，含有中間片段的重新恢復的噬菌體形成藍色噬菌斑；而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無色透明的。單鏈噬菌體載體(M13)最常用的單鏈噬菌體載體是M13和它的改建噬菌體。M13是絲狀噬菌體，有長約6500個核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上，所以它們只能感染雄性細菌，即F’或Hfr細菌。當噬菌體進入細菌細胞后，單鏈的噬菌體DNA轉變成雙鏈復制型(RF)。從細胞中分離的RF可用作克隆雙鏈DNA的載體。當每個細菌細胞里積聚了200到300份RF型拷貝時，

6、M13開始不對稱的合成，即只大量合成DNA雙鏈中的一條鏈。單鏈DNA摻入成熟的噬菌體顆粒，顆粒不斷地從感染細胞上芽生。M13感染雖不殺死細胞，但細胞的生長受到一定的抑制，所以形成混濁的噬菌斑。M13的基因組中除有一段507個核苷酸，其余都含有與其復制有關的遺傳信息。因此，只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。用M13作為分子克隆載體的優(yōu)點是從細菌中釋放出來的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，其中包含了克隆DNA片段的二條互補鏈中的一條，因此可用來作為對DNA測序的模板。另外，可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補的RNA。M13的RF型是雙鏈

7、DNA，便于限制酶的識別和切割，克隆進雙鏈的外源DNA。從細菌培養(yǎng)液中大量抽取單鏈DNA。問題是插入M13的外源DNA超1000bp時就不穩(wěn)定，在噬菌體增殖時會出現(xiàn)缺失。一般說，插入300～400bp是相當穩(wěn)定的。