DB22∕T 3031-2019 禽流感和新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T3031—2019禽流感和新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)法OnestepfluorescentRT-PCRmethodforsimultaneousdetectionoftheAIVand本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印NDV2019-05-27發(fā)布2019-06-17實(shí)施吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T3031—2019本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印前言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧

2、業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：尹仁福、劉新鑫、丁壯、李俊嬌、費(fèi)亦東、范欽磊、肖玉海。本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印I本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T3031—2019本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印禽流感和新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽流感和新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法的原理、試驗(yàn)條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、檢測(cè)方法和結(jié)果。本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽流感和新城疫病毒檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本

3、（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫3原理本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印通過(guò)提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。通過(guò)該反應(yīng)，利用熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，最終計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。4試驗(yàn)條件4.1生物安全要求所有培養(yǎng)物和廢棄物的處置應(yīng)按照GB1

4、9489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4.2防污染措施4.2.1防止污染措施應(yīng)符合GB/T27401的規(guī)定。4.2.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分為相對(duì)獨(dú)立的工作區(qū)域，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。每一個(gè)區(qū)域應(yīng)有專(zhuān)用的儀器設(shè)備。5試劑或材料5.1試劑除有特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純；試驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。1DB22/T3031—20195.1.1磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液pH值范圍為pH7.0?pH7.4，成分為青霉素2000U/mL、鏈霉素2mg/mL、卡那霉素50μg/mL、制菌霉素1000U/mL。5.1.2RNA提取試劑盒。本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印5.1.3熒

5、光探針RT-PCR試劑盒。5.1.4采用無(wú)新城疫、禽流感病毒的陰性質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。5.1.5采用無(wú)RNA酶滅菌超純水作為空白對(duì)照。5.1.6采用已構(gòu)建出的新流感、新城疫病的的陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。5.2材料5.2.1棉拭子。5.2.2雛禽新鮮糞便。5.2.3死禽。采取病料包括腦、肺臟、脾臟。5.2.4離心管。1.5mL。5.2.5微量移液器槍頭。1000μL、200μL、10μL。5.2.6熒光PCR管。5.3引物引物及濃度見(jiàn)表1。本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印表1熒光定量PCR方法所用引物和TaqMan探針序列靶基因引物探針序列（5’～3’）堿基數(shù)工作濃度Ftatacgactcac

6、tatatcttctaaccgaggtcgaaacg39禽流感Rttcttccctgcaaagacatcttc23檢測(cè)引物Pfam-ccctcaaagccgagatcgcgc-tamra21引物10μmol/LFtatacgactcactatattgccagcacaaaaaggtctcc39探針90μmol/L新城疫Rtcatcaccacctatccattcatctt25檢測(cè)引物Pvic-cttcctaggcagagcat-tamra176儀器設(shè)備6.1組織勻漿器。6.2旋渦振蕩儀。6.3高速冷凍離心機(jī)。16000r/min。6.4冰箱。-80℃、-20℃、4℃。6.5微量移液器。

7、6.6熒光定量PCR儀。StepOne型。7樣品7.1采集7.1.1活禽采集的樣品應(yīng)包括氣管和泄殖腔拭子（5.2.1），后者需帶有可見(jiàn)糞便。雛禽可采用收集新鮮糞便（5.2.2）代替。2DB22/T3031—20197.1.2死禽以腦、肺臟、脾臟（5.2.3）為主，也可采集其他病變組織。7.2處理本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印氣管和泄殖腔拭子（5.2.1）放入PBS（5.1.1）中，4℃保存（6.4）。糞便（5.2.2）和攪碎（6.1）的組織，用PBS（5.1.1）制成10