DB22∕T 2909-2018 H5N8亞型禽流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)方法.pdf

《DB22∕T 2909-2018 H5N8亞型禽流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)方法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、ICS11.220B41備案號(hào)：62754-2019DB22吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T2909—2018H5N8亞型禽流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印Methodofthereal-timePCRforthedetectionofHAandNAgenesofAvianinfluenzasubtypeH5N82018-11-12發(fā)布2018-12-30實(shí)施吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T2909—2018本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-20

2、09和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由長(zhǎng)春海關(guān)（原吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局）提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王偉利、姚貴哲、孟慶峰、劉金華、王岸英、王準(zhǔn)、肖芳、馬玲。本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印I本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印DB22/T2909—2018H5N8本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印亞型禽流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了H5N8亞型禽流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)方法的原理、材料與試劑、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適

3、用于H5N8亞型禽流感病毒HA和NA基因檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19438.1禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到的設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）RNA：核糖核酸（Ribonucl

4、eicAcid）DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethypyrocarbonate）HA：血凝素（hemagglutinin）NA：神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase）Taq酶：Taq脫氧核糖核酸聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase）4原理根據(jù)H5N8亞型禽流感病毒HA基因和NA基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，探針結(jié)合部位在擴(kuò)增片段內(nèi)部。HA基因和NA基因探針?lè)謩e在5’端標(biāo)記VIC和FAM熒光素作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端分別標(biāo)記MGB和BHQ1作為淬滅熒光基團(tuán)。反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收

5、，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶發(fā)揮5’→3’的外切核酸酶功能，將探針降解。探針上的熒光基團(tuán)游離出來(lái)，所發(fā)出的熒光不再為淬滅基團(tuán)所吸收而被檢測(cè)儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)。據(jù)此熒光PCR儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)HA基因和NA基因的同步實(shí)時(shí)檢測(cè)。5材料與試劑5.1材料5.1.1離心管（1.5mL、0.2mL）。1DB22/T2909—20185.1.2熒光PCR反應(yīng)管。5.2試劑本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印5.2.1裂解液5.2.2陰性對(duì)照：可采用健康的動(dòng)物組織材料或經(jīng)滅活的不含禽流感病毒的雞胚尿囊液。5.2.3陽(yáng)性對(duì)照：非

6、感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.4氯仿（分析純）。5.2.5異丙醇（分析純）。5.2.675%乙醇。5.2.7DEPC水：0.1%DEPC處理后的去離子水。5.2.82×RT-PCRBuffer5.2.9RTEnzymeMix5.2.10Taq酶5.2.11引物與探針：HA基因：引物F1：5’–CTTGCGACTGGGCTCAGAAAT–3’；引物R1：5’–TTTGGGTGGATTCTTTGTCTGC–3’；探針P1：VIC-CATTCCTTGCCATCC-MGB；NA基因：引物F2：5本標(biāo)準(zhǔn)僅供內(nèi)部使用不得翻印’-CTCCAAGAGGGGAAGATGCT-3’；

7、引物R2：5’-CTGACCTGGAGGTTCGACTA–3’，探針P2：FAM-CGCCCCACCCACACATCAGTTCCCTGT-BHQ1，6儀器設(shè)備6.1旋渦振蕩器。6.2高速冷凍離心機(jī)。6.3微量可調(diào)移液器(10μL、100μL、1000μL)。6.4超低溫冰箱（-80℃）。6.5熒光定量PCR儀。7樣品抽樣按照GB/T19438.1規(guī)定執(zhí)行。8試驗(yàn)步驟8.1核酸抽提8.1.1酚氯仿法8.1.1.1取滅菌的1.5mL離心管（5.1.1），做好標(biāo)識(shí)。8.1.