櫛孔扇貝BAC文庫的構(gòu)建及質(zhì)量評價.pdf

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1、第43卷第11期2013年11月中國海洋大學學報PERl0DICAI。OF0CEANUNIVERSITYOFCHINA43(11)：057～063NOV．，2013櫛孑L扇貝BAC文庫的構(gòu)建及質(zhì)量評價。趙柏淞，程潔，陳亮，于娜，黃曉婷”，包振民(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東青島266003)摘要：本研究構(gòu)建了櫛孔扇貝3個BAC文庫，分別為BamHI文庫，HindⅢ文庫和Sau3AI，其中BamHI文庫包含34560個克隆，平均插入片段為98kb，未發(fā)現(xiàn)空載；HindIll文庫包含1

2、32480個克隆，平均插入片段為106kb，空載率為1．67％；Sau3AI文庫包含23040個克隆，平均插入片段為53kb，空載率為3．33％。3個文庫總共由190080個克隆組成，平均插入片段為98kb，覆蓋櫛孔扇貝基因組的15．4倍。通過對隨機挑選BAC克隆100代的繼代培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排現(xiàn)象，說明所構(gòu)建的BAC文庫是穩(wěn)定的。將所有克隆進行超級池及二級池的構(gòu)建，篩選了3個基因及遺傳圖譜上的7個微衛(wèi)星標記，陽性克隆數(shù)在6～18之間，表明這3個文庫可以在目的基因或標記的篩選、物理圖譜的構(gòu)建及

3、大規(guī)?；蚪M的測序中發(fā)揮重要作用。關(guān)鍵詞：櫛孑L扇貝；BAc文庫；基因組中圖法分類號：S197文獻標志碼：A文章編號：1672—5174(2013)11—057—07櫛孔扇貝(Chlamys．向rreri)是我國北方重要的海水養(yǎng)殖貝類，近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖區(qū)病害頻發(fā)，種質(zhì)衰退，養(yǎng)殖環(huán)境惡化等因素嚴重制約了櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[113]。開展櫛孔扇貝基因組研究，對于了解重要經(jīng)濟性狀的遺傳，開發(fā)重要經(jīng)濟性狀的遺傳調(diào)控基因，指導品種改良和遺傳育種具有重要意義。在櫛孑L扇貝基因組研究過程中，大

4、片段基因組文庫扮演著很重要的角色。張玲玲等構(gòu)建了第一個櫛孔扇貝的Fosmid基因組文庫[4弓]，文庫包含133851個克隆，插入片斷平均長度較小，覆蓋櫛孑L扇貝基因組的4．3倍；隨機挑選Fosmid文庫中2016個克隆進行雙末端測序，獲得了部分基因組序列，對櫛孑L扇貝基因組結(jié)構(gòu)進行了初步分析；利用FISH技術(shù)將12個克隆定位到染色體上，實現(xiàn)了櫛孔扇貝8對染色體的區(qū)分鑒定。張洋等構(gòu)建了櫛孑L扇貝的BAC文庫[6]，由BamHI和MboI文庫組成，文庫共包含81408個克隆，平均插入片段約為113kb，覆蓋率約

5、為櫛孑L扇貝單倍體基因組大小的9．1倍。張曉軍等利用這個BAC文庫構(gòu)建了第一個櫛孔扇貝限制性酶切圖譜[7]，并與櫛孔扇貝的微衛(wèi)星遺傳圖譜進行初步整合。雖然櫛孔扇貝的2個大片段基因組文庫已經(jīng)建成，但是，由于Fosmid文庫插入片段為40kb，覆蓋率偏低，BAC文庫酶切位點過于單一，且文庫構(gòu)建過程時采用了混合個體，以上問題都會影響到櫛孔扇貝物理圖譜的構(gòu)建及大規(guī)模測序和序列拼接等工作。因此本研究采用3種不同的限制性內(nèi)切酶，選擇單一櫛孑L扇貝個體的基因組DNA，以pCClBAC為載體構(gòu)建3個不同的大片段基因組文庫，

6、并對文庫進行質(zhì)量評價，為其遺傳圖譜與物理圖譜的整合以及全基因組框架圖構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1．1材料實驗選用的櫛孔扇貝采自遼寧大連獐子島附近深水域，活體解剖剝離閉殼肌、鰓絲、性腺、外套膜及內(nèi)臟團，經(jīng)液氮冷凍后，存放于--80oc超低溫冰箱保存。1．2方法結(jié)合Peterson[8]和ZhangE9]的BAC文庫構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建櫛孑L扇貝個體BAC文庫。1．2．1BAC載體的獲取本實驗所需載體來自美國EPICENTRE公司的CopyControlTMBACCloningKit文庫構(gòu)建試劑盒。1．2．2櫛孔扇貝

7、高分子量DNA制備取櫛孑L扇貝材料液氮研磨后，分離出細胞核，用1％的低熔點瓊脂糖進行包埋制成瓊脂糖塊。瓊脂糖塊經(jīng)蛋白酶K消化48h，再用PMSF(苯甲基磺酰氟)處理瓊脂糖塊，然后存放于4℃的TE備用。1．2．3基因組DNA部分酶切為確定獲得合適的酶切條件，對于3種酶分別進行酶切反應的條件優(yōu)化。以BamHI為例，取3個瓊脂糖塊，每個瓊脂糖塊切成*基金項目：國家自然科學基金項目(31270047)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2012AAl0A410，2012AA092204)；國家科技支撐計劃項目(2011B

8、ADl3801)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資助收稿日期：2012一lO一31；修訂日期：2013—03—12作者簡介：趙柏淞(1985一)，男，博士。E—mail：jobson007@163．corn**通訊作者：E—mail：xthuang@OUC．edu．cn中國海洋大學學報均勻的8小塊微瓊脂糖塊，將每4個微瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移到1．5mL離心管中，加入預冷的Incubationbuffer，冰浴120rain，