利用ssr分子標(biāo)記鑒定雜交稻種子齊兩優(yōu)918純度

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1、利用SSR分子標(biāo)記鑒定雜交稻種子齊兩優(yōu)918純度摘要：種子純度是雜交水稻種子質(zhì)量的核心指標(biāo)。微衛(wèi)星技術(shù)（SSR分子標(biāo)記技術(shù)）因其具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確可靠、易于操作等優(yōu)點(diǎn)在種子純度鑒定中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。采用48個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)雜交水稻組合齊兩優(yōu)918的雙親及F1之間的多態(tài)性進(jìn)行篩選和純度檢測(cè)技術(shù)研究，為種子生產(chǎn)以及種子上市銷售做好質(zhì)量監(jiān)督，杜絕質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)過(guò)篩選得到如下結(jié)果：在對(duì)48對(duì)引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)有5對(duì)引物在雙親間顯示穩(wěn)定多態(tài)性，在雜種F1上表現(xiàn)為父母本共顯性條帶，表明該5對(duì)引物適宜于齊兩優(yōu)918雜交種子純度鑒定，可用于種子質(zhì)量

2、監(jiān)控。關(guān)鍵詞：雜交水稻；種子純度鑒定；微衛(wèi)星分子標(biāo)記（SSR分子標(biāo)記）中圖分類號(hào)S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1007-7731（2013）17-120-02種子純度是雜交水稻種子質(zhì)量的核心指標(biāo)，是種子質(zhì)量分級(jí)的主要標(biāo)準(zhǔn)，是企業(yè)購(gòu)銷種子的關(guān)鍵依據(jù)，歷來(lái)受到種子管理部門、種子企業(yè)和農(nóng)民的密切關(guān)注。而無(wú)論三系還是兩系雜交稻，高純度雜交種都是發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)增產(chǎn)潛力的基礎(chǔ)，種子純度不夠會(huì)給種植戶造成減產(chǎn)和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。品種純度檢驗(yàn)的方法很多，根據(jù)其所依據(jù)的原理不同主要分為形態(tài)鑒定、物理化學(xué)法鑒定、生理生化法鑒定、分子生物學(xué)方法鑒定、細(xì)胞學(xué)方法鑒定。其中

3、分子測(cè)定技術(shù)又分為RFLP、AFLP、RAPD、SSR分子檢測(cè)技術(shù)。而SSR(SimpleSequenceRepeats,簡(jiǎn)單重復(fù)序列)分子技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)技術(shù)，其SSR標(biāo)記是一類由幾個(gè)核昔酸(一般為1?6個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核昔酸的串聯(lián)重復(fù)序列，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)數(shù)量豐富，覆蓋了整個(gè)基因組，揭不的多態(tài)性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德?tīng)柗绞竭M(jìn)行遺傳,呈共顯性；(4)每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物順序決定，便于

4、不同的實(shí)驗(yàn)室之間相互交流合作開(kāi)發(fā)特異性引物。因而SSR分子檢測(cè)技術(shù)在種子純度鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。筆者利用SSR分子檢測(cè)技術(shù)，對(duì)齊兩優(yōu)918母本033S和父本R918進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)和電泳圖譜的分析，結(jié)果選出了5對(duì)引物，這5對(duì)引物對(duì)齊兩優(yōu)918的母本033S和父本R918都顯示出了很好的多態(tài)性，并在齊兩優(yōu)918±顯示出共顯性特征，因此適宜于對(duì)其進(jìn)行純度鑒定以及質(zhì)量監(jiān)控。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料水稻種子齊兩優(yōu)918的不育系033S在光照培養(yǎng)箱(恒溫30°C)中培養(yǎng)生長(zhǎng)7d的幼苗；恢復(fù)系R918在光照培養(yǎng)箱（恒溫30°C）中培養(yǎng)生長(zhǎng)7d的幼苗；雜交

5、種（F1）齊兩優(yōu)918在光照培養(yǎng)箱（恒溫30°C）中培養(yǎng)生長(zhǎng)7d的幼苗。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1DNA的提取DNA的提取采用CTAB法：取一棵幼苗，用剪刀剪碎后放在2.0mL的離心管中，加入液氮，研至粉狀即可，然后在離心管中加入60011L的裂解液，把離心管蓋好放在65°C的水浴鍋里預(yù)熱30min,期間要每隔lOmin反復(fù)顛倒幾次。預(yù)熱后加入氯仿：異戊醇抽提液600pL,把離心管蓋好放入低溫髙速冷凍離心機(jī)中以13000r/min離心15?20min,然后把上清液轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，加入1/10體積的醋酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，再放入離

6、心機(jī)中以13000r/min離心5min,倒出上清液，這時(shí)在底部就可以看到白色透明沉淀。再加入500uL的70%乙醇，離心2min,開(kāi)蓋后將底部白色沉淀風(fēng)干即可，加入100yL的TE緩沖溶液，-2（rc保存?zhèn)溆谩?.2.2PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為:10XBuffer倍液，dNTP0.12mmol/L,Mg2+1.5mmol/L,每種引物1Umol/L,0.2單位Taq酶，10ng的DNA,不足10uL的部分用超純水補(bǔ)足（共計(jì)10uL）oPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min,然后94°Clmin,56°C30s,72°C30s,進(jìn)行35個(gè)

7、循環(huán)，再在72°C延伸7mino最后冷卻至re。1.2.3聚丙烯酰胺凝膠電泳把電泳槽裝好后在底部用1%的瓊脂凝膠封底，用聚丙烯酰胺凝膠溶液（8%的聚丙烯酰胺溶液+0.5%體積的10%過(guò)硫酸鐵溶液+0.1%的TEMED）灌膠,快速插入梳子。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入澳酚藍(lán)指示劑，待膠凝固后進(jìn)行點(diǎn)樣。按正負(fù)極接通電泳儀后，180?200V的電壓下跑電泳2.5h左右。將膠放入固定液（體積比0.5%乙酸和體積比10%的乙醇）中固定12min,然后倒去固定液,用染色液（AgN03溶液）染色12min,倒去染色液，用純水漂洗2次，每次1?2mino最后將

8、凝膠放入顯色液（體積比0.4%的甲醛溶液和質(zhì)量體積比1.5%的NaOH溶液）中直至條帶出現(xiàn)，并拍照記錄。2結(jié)果與分析齊兩優(yōu)918及其親本用48對(duì)引物進(jìn)行篩（下轉(zhuǎn)12