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《safracinb的菌種選育及發(fā)酵工藝_王向陽》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中國醫(yī)藥工業(yè)雜志微生物藥物與生物技術(shù)的菌種選育及發(fā)酵工藝王向陽,陳少欣中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院,,創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海摘要一株高產(chǎn)突變:以產(chǎn)生菌熒光假單胞菌為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外和亞硝基胍誘變和篩選,得到株其的產(chǎn)量為通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,得到最適培養(yǎng)基配方(甘露醇甘油,。黃豆餅粉,玉米漿干粉氣化銨在上述條件下一。的搖瓶產(chǎn)量為。進(jìn)步在發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng),的產(chǎn)量達(dá)到:熒光假單胞菌關(guān)鍵詞;菌種選育:發(fā)酵中圖分類號(hào):文獻(xiàn)標(biāo)志碼:文章編號(hào):,,;是加勒比海鞘本,科學(xué)家開發(fā)出從半合成口一種四氫異喹啉的生
2、產(chǎn)工藝提取物中的。是從焚光假單胞菌而生物堿,年由西班牙的發(fā)酵液中分離到的生物堿類抗生’公司開發(fā)為治療軟組織肉瘤和卵巢癌的素,和的結(jié)構(gòu)見圖。目前的發(fā)酵⑴,藥物。抗腫瘤活性研究表明其活性比臨床單位較低本研究旨在通過菌種選育和優(yōu)化發(fā)酵培,廣泛使用的喜樹堿,,為合成提供關(guān)鍵前體、多柔比星、博來霉素等高適養(yǎng)基組成提高其產(chǎn)量用于蒽環(huán)類藥物和異環(huán)磷酰胺治療失敗°的晚期組織°、肉瘤患者,直接提取。由于海鞘中含量低。生產(chǎn)成本過高’不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)為降低生產(chǎn)成收稿日期:“”基金項(xiàng)目:國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)作者簡介,從事生物藥
3、物研究。:王向陽(丨,助理研究員丨通信聯(lián)系人:陳少欣研究員,從事生物藥物研究。圖和的化子!口構(gòu):..114中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,,儀器與試藥結(jié)果顯示,照射熒光假單胞菌的致死型高效液相色譜儀(美國公司):率為將誘變后的菌懸液稀釋涂布于。型玻璃發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有平板,培養(yǎng)挑取單菌落到涂有大腸桿菌限公司)。的平板上,繼續(xù)培養(yǎng)挑取抑菌圈較“”對(duì)照品(本室制備,純度亞硝基胍大的單菌落,按項(xiàng)下方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培曰本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;乙腈和甲醇為色譜純,養(yǎng),從中挑選發(fā)酵單位提高的突變株,經(jīng)過連續(xù)幾其他試劑均為分析
4、純。輪誘變后,得到高產(chǎn)菌株產(chǎn)量為熒光假單胞菌本室保藏)。比出發(fā)菌株提高了倍。固體培養(yǎng)基蛋白胨酵母提誘變:精密稱取加入適量取物,瓊脂。丙酮溶解,然后加入磷酸鹽緩沖液(,種子培養(yǎng)基葡萄糖丨,蛋白胨配制成的母液。以丨,為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變,將培養(yǎng)好的斜面用發(fā)酵培養(yǎng)基‘:甘露醇葡萄糖黃豆餅制成菌懸液,取出置滅菌的三角粉’,;瓶中,加入適量母液,使終濃度分別為°。、、、和振蕩(方法與結(jié)果培養(yǎng),考察的最適濃度;并以最適濃培養(yǎng)條件度分別處理、、、、和以確定斜面培養(yǎng):將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)作用時(shí)間。結(jié)果顯示,終濃度作用基上°
5、,培養(yǎng)熒光假單胞菌的致死率為。同上操種子液體培養(yǎng):將斜面菌種接種到裝量為作進(jìn)行篩選,經(jīng)過連續(xù)幾輪誘變后,得到高的種子搖瓶中。,振蕩產(chǎn)菌株產(chǎn)量為比出發(fā)菌株培養(yǎng)。提高了倍。發(fā)酵液體培養(yǎng):將種子液按接種量轉(zhuǎn)接到將突變株接種到斜面培養(yǎng)基上連續(xù)。裝量為的發(fā)酵搖瓶中”,于振蕩傳代次,分別按項(xiàng)下方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)。結(jié)果產(chǎn)量均大于表明該突變株遺傳穩(wěn)的含量測定定性良好。取發(fā)酵培養(yǎng)液離心(取發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化上清液經(jīng)濾膜過濾后采用法測定。碳源優(yōu)化”色譜條件:色譜柱柱(以項(xiàng)下的發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將流動(dòng)相乙腈:乙酸銨溶其中的葡萄
6、糖分;別替換為濃度為和的麥?!啊保毫魉贉匾海?;柱檢測波芽糖、、、半乳糖乳糖蔗糖、甘油和豆油,按長進(jìn)樣量口。根據(jù)對(duì)照品濃度計(jì)算發(fā)項(xiàng)下方法發(fā)酵培養(yǎng)后測定。結(jié)果見表。酵液中的含量。由結(jié)果可知,該菌株能利用多種碳源進(jìn)行生長,菌種誘變與篩選當(dāng)以的甘油為碳源時(shí),相對(duì)產(chǎn)量較高??赡茏贤猓ㄕT變:將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌以甘油作為碳源可以減少葡萄糖效應(yīng),從而有助于水制成菌懸液,取出置滅菌的培養(yǎng)皿中,次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。紫外燈下邊攪拌邊照射一(功率照射距離進(jìn)步調(diào)整培養(yǎng)基中甘露醇(分別照射、、、、和。和甘油(的比例,兩者總量為中國醫(yī)
7、藥工業(yè)雜志,表不同碳源對(duì)產(chǎn)量的影響碳源葡萄糖麥芽糖半乳糖乳糖蔗糖甘油豆油“相對(duì)產(chǎn)量注:括號(hào)內(nèi)外分別是和濃度相應(yīng)結(jié)果;葡萄糖參照濃度為,結(jié)果顯示,加入適量甘油有助于提高產(chǎn)量但其攪拌溶氧(自控在以上(與產(chǎn)量隨甘油濃度的升高而下降,。當(dāng)甘露醇為轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián))通氣量罐壓用,相對(duì)產(chǎn)量較高甘油為時(shí)。氫氧化鈉溶液維持值約。從發(fā)酵過,每隔定時(shí)取樣,結(jié)果見圖氮源優(yōu)化程的第開始。,以碳源優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將可見,在發(fā)酵過程的第,菌體開始迅速生長的黃豆餅粉,值和溶氧快速下降,(對(duì)照)分別替換為不同濃度(%此時(shí)菌體濃度和轉(zhuǎn)速升高
8、的黃豆餅粉、氯化為了維持足夠的溶氧,轉(zhuǎn)速由增加到(、和玉米漿干粉,按和硫酸銨、、和小麥蛋白粉、。在發(fā)酵過程的第開始合成比菌(均為一,酵母粉和酵母提取物。體生長推遲段時(shí)間。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加產(chǎn)(均為、和三水平)“”%量逐漸提高項(xiàng)下方法發(fā)酵培養(yǎng)測得相對(duì)產(chǎn)量,在時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高為按(,、、分別為、、黃豆餅粉)、但發(fā)酵后期由于甘露醇濃度的快速降低導(dǎo)致菌體的,玉米漿干粉,、、、氯;衰退產(chǎn)量也隨之降