地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化.doc

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1、地衣芽鞄桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化【摘要】：微生態(tài)制劑以其無毒副作用、無耐藥性、無殘留，能有效克服抗生素濫用等優(yōu)點(diǎn)而為廣大消費(fèi)者所青睞。本文以一株地衣芽抱桿菌為研究對象，通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配比：葡萄糖1.5%,酵母抽提物1.0%,硫酸鎂0.3%o最佳培養(yǎng)溫度為35°C,最適接種量為5%,最佳初始pH6.5o【關(guān)鍵詞】：地衣芽孑包桿菌正交實(shí)驗(yàn)酵母抽提物【分類號】：S96&4在過去的50年，抗生索曾經(jīng)為畜牧業(yè)做出了很大的貢獻(xiàn)，但相繼出現(xiàn)的耐藥性問題和抗生素殘留問題，使科學(xué)家們將動物藥物添加劑的研究方向投向具有生長促進(jìn)作用和保健效果的飼用

2、微生態(tài)制劑。微生態(tài)制劑具有無毒副作用、無耐藥性、無殘留以及效果顯著、成木低等諸多優(yōu)點(diǎn)，作為抗生素替代品是包括酸制劑在內(nèi)的其他產(chǎn)品無法比擬的［1］,因飼用微生態(tài)制劑可做為飼料添加劑直接使用，美國FDA和我國農(nóng)業(yè)部對可做為微生態(tài)制劑的微生物種類都有嚴(yán)格的規(guī)定［2.3］。目前國外微生態(tài)制劑的研究多是圍繞乳酸桿菌屬、枯草桿菌屬以及一些鏈球菌類進(jìn)行的；我國則以芽抱桿菌、乳酸桿菌研制為主。如谷春濤等通過大量的數(shù)據(jù)論證了地衣芽抱桿菌TS-1的廉價培養(yǎng)基，并使其生物量達(dá)到前所未有的水平［4］,豐貴鵬等在其研究的基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化使培養(yǎng)基更為澄清［5

3、］,為規(guī)?；a(chǎn)提高產(chǎn)品品質(zhì)提供了重要參考依據(jù)；鄧菊云、吳振強(qiáng)、張錦亮等優(yōu)化了地衣芽抱桿菌固體發(fā)酵[6.7.8]o本文以一株地衣芽抱桿菌（Bac訂luslicheniformis）為研究對象，用單因素變量和正交實(shí)驗(yàn)對其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。一材料與方法㈠實(shí)驗(yàn)材料1?菌種地衣芽抱桿菌（Bacilluslicheniformis）由唐山師范學(xué)院微生物教研室提供2?培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基:蛋白月東1%；酵母抽提物（膏）0.5%；氯化鈉1%；自然pH發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖1%;蛋白豚1%;氯化鈉0.5%；pH7.03?主耍試劑蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、麥芽

4、糖、玉米漿粉、胰蛋白豚、酵母抽提物（膏）、牛肉膏、黃豆餅粉、尿索4?儀器設(shè)備控溫?fù)u床、高壓滅菌鍋、電子天平、pH-3CpH測定儀、無菌操作臺、紫外分光光度計(jì)㈡方法1?培養(yǎng)方法（1）菌種活化將保藏的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h備用。⑵種子液的制備取一環(huán)活化的菌種，接入裝量為100mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37°C,160r/min,培養(yǎng)18h。⑶搖瓶培養(yǎng)種子液以1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量100ml/250ml三角瓶）中。37°C,160r/min,振蕩培養(yǎng)24h進(jìn)行單因素的發(fā)酵條件研究。2?發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)⑴碳源分

5、別用1%葡萄糖、玉米淀粉和麥芽糖等量替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖制成培養(yǎng)基。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，24h后測定發(fā)酵液中的活菌含量以確定最佳碳源。⑵氮源分別用1%酵母抽提物、牛肉膏、尿素、氯化鍍替代基礎(chǔ)發(fā)酵液1%的胰蛋白月東。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，24h后測定發(fā)酵液中的活菌含量,以確定最佳氮源。⑶無機(jī)鹽分別用0.5%硫酸猛、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣及不加無機(jī)鹽的空白，替代等量的發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化鈉（0.5%）。采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，24h后測定發(fā)酵液中的活菌總數(shù)，以確定最佳無機(jī)鹽。㈢止交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將篩選出的最優(yōu)碳源、氮源、和無機(jī)鹽3個重耍因素，選用3因素3水

6、平L9(33)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基配比(以下簡稱優(yōu)化培養(yǎng)基)，正交實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1和表2㈣發(fā)酵條件的優(yōu)化采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方，對最佳發(fā)酵時間、溫度、初始pH、接種量進(jìn)行逐一優(yōu)化。㈤測定方法活菌總數(shù)測定采用稀釋平板計(jì)數(shù)法；菌體生長曲線及發(fā)酵液生物量采用比濁法測定[9.10]；pH-3C測定儀測定菌液pHo二結(jié)果與討論㈠發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化⑴碳源分別以1%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、和玉米淀粉作為碳源，其他組分均相同進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵液屮的活菌總數(shù)。圖1不同碳源對活菌總數(shù)的影響由圖1可知，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖為碳源時地衣芽抱桿菌的生長明顯優(yōu)于玉米淀粉

7、，利用前3種碳源發(fā)酵后，地衣芽抱桿菌活菌數(shù)超過2.2X1010CFU/mLo而利用玉米淀粉時其活菌數(shù)在0.9X1010CFU/mL以下,說明該地衣芽抱桿菌利用單糖和二糖的能力優(yōu)于淀粉。該地衣芽抱桿菌生長的最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麥芽糖。⑵氮源以1%葡萄糖為碳源，分別以1%尿素、氯化錢、牛肉膏、酵母抽提物、胰蛋白月東為氮源制成發(fā)酵培養(yǎng)基。圖2不同氮源對活菌總數(shù)的影響由圖2可知有機(jī)氮源效果要明顯優(yōu)于無機(jī)氮源。利用有機(jī)氮源發(fā)酵后,地衣芽抱桿菌活菌數(shù)都超過2.20X1010CFL/nL,而利用無機(jī)氮源時的活菌數(shù)在1.0X1010CFUM以下，說明該

8、地衣芽抱桿菌利用有機(jī)氮源的能力優(yōu)于無機(jī)氮源。地衣芽抱桿菌生長的最適氮源是酵母抽提物，這與酵母抽提物富含氨基酸、小肽、核昔酸、B族維生素等