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《蛋白水解度測(cè)定方法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、蛋白水解度（DH）測(cè)定方法—OPA法一、定義水解度（DH）是指蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵占總肽鍵的百分比。其基本計(jì)算公式如下：被水解的肽鍵數(shù)hDH=×100%=×100%蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)htothtot的值根據(jù)不同的底物蛋白會(huì)有所不同，h是用等價(jià)serineNH2表示的。????????2???=meqv/gprotein?更多α，β，htot的精確數(shù)值請(qǐng)參見(jiàn)備注。此處的DH是指樣品相對(duì)于原始底物的水解度，如果要計(jì)算水解反應(yīng)前后的水解度，需要使用如下公式：h1?h0DH=×100%htoth0:水解反應(yīng)前樣品相對(duì)原始底物的水解度；h1:水解反應(yīng)后樣品相對(duì)原始底物的水解度。二、原理OPA（鄰苯二甲醛）法
2、測(cè)定蛋白質(zhì)水解度的原理是OPA在β-巰基乙醇的存在下會(huì)與自由α-氨基形成黃色化合物，其在340nm處有特征吸收，用分光光度計(jì)可檢測(cè)其OD值。實(shí)際使用中1，4二巰基蘇糖醇（DTT）比β-巰基乙醇更易使用。三、試劑測(cè)試所需試劑及設(shè)備如下：硼砂（CAS1303-96-4）AR十二烷基硫酸鈉（SDS,CAS151-21-3）AR鄰苯二甲醛（OPA，CAS643-79-8，純度97%）（sigma）1,4-二巰基蘇糖醇（DTT，CAS3483-12-3，純度99%）（sigma）絲氨酸（serine）標(biāo)準(zhǔn)品（CAS302-84-1）（sigma）紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（可測(cè)340nm吸光值）容量瓶100ml
3、，200ml，500ml各數(shù)個(gè)10ml測(cè)試管數(shù)個(gè)3.1OPA試劑A1.將7.620g硼砂（CAS1303-96-4）和200mg十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于150ml去離子水中。溶解完全后方可加入其他試劑。A2.將160mg鄰苯二甲醛（OPA，純度97%）溶解于4ml無(wú)水乙醇中。溶解完全后將此OPA溶液轉(zhuǎn)移至上述A1溶液中，并用去離子水沖洗，轉(zhuǎn)移。A3.將176mg1,4-二巰基蘇糖醇（DTT，純度99%）加入到A1溶液中，去離子水沖洗，轉(zhuǎn)移。A4.用去離子水將A1溶液定容至200ml.此試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。3.2絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液將50mg絲氨酸（serine）溶解于500ml去離子水中。此溶液中S
4、erine-NH2約為0.9516meqv/L.3.3樣品溶液將Xg樣品溶解于100ml去離子水中，X的值在0.1～1.0之間。如果樣品蛋白含量為80%，則X取0.1g，如果樣品蛋白含量為8%，則X取1.0g。*水解實(shí)驗(yàn)中可取100ul水解樣品加入到900ul，5%（W/W）熱的（85℃）SDS溶液中，保溫5min滅酶。樣品保存在-18℃以備測(cè)試。計(jì)算時(shí)注意蛋白濃度的變化。四、測(cè)試步驟使用分光光度計(jì)測(cè)試所有樣品的340nm吸光值，空白對(duì)照為去離子水。1.加3mlOPA試劑到所有的測(cè)試管中。分析一個(gè)樣品所需的測(cè)試管：標(biāo)準(zhǔn)溶液4個(gè)空白4個(gè)樣品溶液2×2個(gè)每個(gè)樣品須測(cè)2次，每次需有一個(gè)平行樣，故需4
5、個(gè)測(cè)試管。2.標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試將400ul絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一個(gè)裝有3mlOPA試劑的測(cè)試管中（時(shí)間點(diǎn)0），混合均勻（5S）后精確靜置2min后立即讀取340nm的吸光值。在測(cè)空白和樣品值之前測(cè)2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，另2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)完空白和樣品后再測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值取4次的平均值。一般情況下ODstand.≈0.83.空白測(cè)試將400ul去離子水加入到一個(gè)裝有3mlOPA試劑的測(cè)試管中（時(shí)間點(diǎn)0），混合均勻（5S）后精確靜置2min后立即讀取340nm的吸光值。測(cè)4次空白取平均值。一般情況下ODblank≈0.07。*如果用5%SDS溶液取樣滅酶，則空白就是5%SDS溶液。4.樣品測(cè)試將400ul樣品溶液
6、加入到一個(gè)裝有3mlOPA試劑的測(cè)試管中（時(shí)間點(diǎn)0），混合均勻（5S）后精確靜置2min后立即讀取340nm的吸光值。因?yàn)槲庵禃?huì)隨時(shí)間變化，所以讀取OD值的時(shí)間必須是同樣的（2min）。五、計(jì)算5.1計(jì)算h????????????????0.1?100SerineNH2=?0.9516meqv/L??/???????????????.???????????SerineNH2meqvserineNH2/gproteinXgsample(0.1~1.0g)Pprotein%insample0.1samplevolumeinL????????2??h=meqv/gprotein?各底物的α和β具體
7、數(shù)值見(jiàn)附表。如果未對(duì)底物進(jìn)行測(cè)試，α和β可按1.00和0.40粗略計(jì)算。5.2計(jì)算DH?1??0DH=*100%????h0:水解反應(yīng)前樣品相對(duì)原始底物的水解度；h1:水解反應(yīng)后樣品相對(duì)原始底物的水解度。備注：大豆、面筋、酪蛋白、乳清、明膠、肉、魚OD值在0.2～1.2之間的讀數(shù)會(huì)比較準(zhǔn)確，太小或太大精確度都會(huì)有影響。因此須注意絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度和樣品中蛋白濃度是否合適。ReferenceP.M.N
