順鉑作用于耐順鉑卵巢上皮癌細(xì)胞后其細(xì)胞生物學(xué)特性的改變.pdf

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1、廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2013Feb：30(1)JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY7·33·順鉑作用于耐順鉑卵巢上皮癌細(xì)胞后其細(xì)胞生物學(xué)特性的改變石麗君于紅靜李力王琪△(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院南寧530021)摘要目的：探討耐順鉑卵巢癌SKOV3／DDPⅡ細(xì)胞對(duì)于順鉑作用后其細(xì)胞周期、凋亡、增殖及鉑類耐藥相關(guān)基因ARHGDIB和CCND1表達(dá)量的變化。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度和時(shí)間順鉑作用后SKOV3／DDPII細(xì)胞周期和凋亡率的變化，并與標(biāo)記GFP的上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV

2、3一GFP(敏感株)相比較；通過(guò)3-(4，5一二甲基噻唑一2)一2，5一二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)不同濃度和時(shí)間順鉑作用后細(xì)胞增殖的變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT—PCR)檢測(cè)裸鼠體內(nèi)瘤塊耐藥基因CC—ND1和ARHGDIB基因的表達(dá)情況。結(jié)果：半抑制濃度的順鉑作用48h后，SKOV3一GFP和SKOV3／DDP1I兩株細(xì)胞分布于G。／G期的比例相對(duì)于無(wú)順鉑處理組明顯下降(P

3、8h內(nèi)SKOV3一GFP和SKOV3／DDPII兩株細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間和濃度的增大而增大；以9．9，19．8，29．7“mol／L濃度的順鉑處理6d以后，SKOV3／DDP1I的增殖抑制得到解除，并繼續(xù)生長(zhǎng)，而SKOV3一GFP細(xì)胞則隨順鉑作用時(shí)間延長(zhǎng)增殖持續(xù)受到抑制。順鉑作用體內(nèi)移植瘤5次后，CCND1在SKOV3／DDP1I一5的相對(duì)表達(dá)比sK0V3／DDPII一0增高92．98倍，作用第8次后，ARHGDIB在SKOV3／DDPⅡ一8的相對(duì)表達(dá)比SKOV3／DDPⅡ一0增高2．51倍。結(jié)論：具有耐藥表型的卵巢

4、上皮癌細(xì)胞在順鉑作用下降低分布于G。／G期細(xì)胞數(shù)使細(xì)胞生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，但在順鉑刺激后腫瘤細(xì)胞過(guò)度表達(dá)CCND1基因使細(xì)胞J~il通過(guò)G／s檢查點(diǎn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)上調(diào)表達(dá)ARHGDIB基因抵抗順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞耐順鉑卵巢癌；順鉑；周期分布；增殖；凋亡中圖分類號(hào)：R737．31文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005—930X(2013)01—0033—05順鉑是卵巢癌一線的化療藥。對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性是影1．4細(xì)胞凋亡率測(cè)定：將SKOV3一GFP和SKOV3／DDPⅡ響卵巢癌以順鉑為主的聯(lián)合化療方案治

5、療效果的一個(gè)重要細(xì)胞以每孔2x10個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板。以濃度分別為原因。耐藥的卵巢癌細(xì)胞是如何抵抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋9．9，19．8，29．7mol／L和39．6mol／L的順鉑處理各細(xì)胞，亡，其機(jī)制到目前為止還未完全清楚。因此，我們選用裸鼠于12，z4，36h和48h時(shí)收集細(xì)胞，上流式儀檢測(cè)細(xì)胞的凋體內(nèi)誘導(dǎo)的SK0V3／DDPⅡ耐藥細(xì)胞株為模型，初步探討卵亡率，方法按凋亡試劑盒(BDPharmingenAnnexinV：PE巢癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑作用的抵抗機(jī)制，為耐藥逆轉(zhuǎn)研究奠定ApoptosisDetectionK

6、itI)說(shuō)明書進(jìn)行，每處理3次重復(fù)。理論基礎(chǔ)。1．5細(xì)胞增值檢測(cè)：將SKOV3一GFP和sK0V3／DDPⅡ細(xì)胞以每孔1000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板。以濃度分別為9．9，1材料和方法19．8，29．7mol／L和39．6~mol／L的順鉑處理各細(xì)胞，對(duì)照組為DulcetMeaglemedia(DMEM)培養(yǎng)液，DDP作用24hI．1材料：sKOV3一GFP和sK0V3／DDPⅡ細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)后換為普通DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。DDP作用24h后(即室自建，順鉑為山東齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，3-(4，5-二甲基順鉑作用后

7、第1天)，每孑L加入5g／L的MTT20L，繼續(xù)培噻唑一2)-2，5-Z．苯基四氮唑溴鹽(MTT)由濟(jì)南翔科生物技術(shù)養(yǎng)4h后，棄上清，每孔加入100“L二甲基亞砜溶解，用酶標(biāo)有限公司生產(chǎn)，細(xì)胞周期試劑盒(CycletestPlusDNARea—儀檢測(cè)波長(zhǎng)為540nm各孑L光密度值，以后每天檢測(cè)1次，直gentKit)和凋亡試劑盒(AnnexinV：PEApoptosisDetection至加藥后第9天。細(xì)胞的增殖率／抑制率一(當(dāng)天所測(cè)吸光KitI)和Influx流式細(xì)胞儀均為美國(guó)BD產(chǎn)品。sYBR度一同一細(xì)胞前一

8、天所測(cè)得吸光度)／同一細(xì)胞前一天所測(cè)PremixExTaqII購(gòu)自TAKARA公司，M—MLVReverse得吸光度×100％。Transcriptase由Promega公司提供。1．6QRT—PCR檢測(cè)鉑類耐藥相關(guān)基因的表達(dá)：SKOV3一1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸鼠(SPFBalB／C)由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)GFP和sKOV3／DDPII細(xì)胞接種于裸鼠腹股溝皮下成瘤后，驗(yàn)中心提供