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《高質(zhì)量匍枝根霉cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、第29卷第2期安徽工程大學學報Vo1．29．NO．22014年6月JournalofAnhuiPolytechnicUniversityJun．，2014文章編號：16722—477(2014)02—0035—04高質(zhì)量匍枝根霉cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定李祥林，湯斌，李松(安徽工程大學微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000)摘要：從匍枝根霉總RNA出發(fā)純化獲得mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成eDNA，構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫，為快速篩選和研究匍枝根霉相關(guān)關(guān)鍵基因提供了基礎．研究采用CHROMSPIN柱回收大于500bp的e
2、DNA并連接pUCm-T載體，成功構(gòu)建了匍枝根霉cDNA文庫．鑒定結(jié)果顯示：文庫庫容為1．95X10。cfu，文庫滴度為7．84×10cfu／mL，該文庫中cDNA片段大小分布在500~4000bp，文庫重組率為96．關(guān)鍵詞：匍枝根霉；cDNA文庫；鑒定中圖分類號：Q93文獻標識碼：A匍枝根霉TP一02是一株具有高效降解纖維素能力的接合菌門匍枝根霉亞種[1]．目前，國內(nèi)對匍枝根霉的研究主要集中在纖維素酶E、脂肪脫氫酶[3]、木聚糖酶[4等方面．本實驗室已從匍枝根霉菌株中成功分離篩選獲得3個內(nèi)切葡聚糖苷酶]基因和2個f}-葡萄糖苷酶[
3、6基因．該菌株與工業(yè)菌株里氏木霉降解纖維素的能力相比，具有發(fā)酵周期短、酶活力高等優(yōu)點[7]．建立DNA文庫可有效獲取或篩選目的基因L8]，為了進一步豐富和健全匍枝根霉的纖維素酶酶系基因，構(gòu)建高質(zhì)量匍枝根霉eDNA文庫具有重要意義．本文擬從匍枝根霉菌株中提取總RNA，分離純化獲得mRNA，連接pUCm-T載體，導人大腸桿菌DH5a，構(gòu)建cDNA文庫．通過菌落計數(shù)、藍白斑篩選對文庫庫容和滴度、文庫重組率及插入片段大小進行鑒定，并對文庫質(zhì)量進行分析，從而構(gòu)建高質(zhì)量eDNA文庫，為纖維素降解過程中關(guān)鍵基因的篩選提供基礎．1材料和方法1．1實
4、驗材料(1)菌株、載體和培養(yǎng)基．本研究中匍枝根霉菌株，大腸桿菌DH5a、pUCm—T載體均保管于安徽工程大學3R實驗室．PDA培養(yǎng)基(g／L)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，pH自然．LB培養(yǎng)基(g／L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉log．根霉發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基：2不同顆粒度的玉米秸稈、稻草與麥稈，5麩皮浸出汁，(NH)2SO3，KH2PO1％，MgSO·7H2O1％，CaC122，Tween800．025oA，微量元素液等均參照文獻[9]配制．(2)主要試劑．Trizol提取試劑盒、mRNA純化試劑盒，柱式PCR產(chǎn)物純化
5、試劑盒，質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒等，均購自上海生工．Taq酶，M—MLVRTasecDNASynthesisKit、T4DNA連接酶購自寶生物(3v連)有限公司．1．2實驗方法(1)匍枝根霉總RNA的提?。畬①橹Ω咕杲臃N到PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5d，轉(zhuǎn)接到液體PDA種子液中培養(yǎng)24h，8接種于CMC-Na誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)60h，此時，菌體處于生長對數(shù)期，體內(nèi)所含基因豐富，為構(gòu)建eDNA文庫提供了基礎．過濾收集新鮮菌體，無菌水洗滌數(shù)次，冷凍干燥．取1g菌絲體液氮充分研磨．Trizol法提取總RNA，并用0．8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測
6、．(2)mRNA的分離純化．用Oligo(dT)Cellulose對總RNA進行分離純化，提取mRNA．具體步驟參照試劑盒說明書進行．(3)cDNA雙鏈的合成及修飾．取1g純化的mRMA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一條鏈，使用E．coliRNaseH使DNA—RNA雜合體的RNA鏈產(chǎn)生缺口，在E．coliPolymeraseI與E．coliDNA收稿日期：2014—01—03基金項目：國家自然科學基金資助項目(31270315)作者簡介：李祥林(1989一)，男，安徽廬江人，碩士研究生．通訊作者：湯斌(1954一)，男，安徽桐
7、城人，教授，碩導．安徽工程大學學報第29卷Ligase的作用下，合成eDNA第二條鏈．使用0．8％瓊脂糖凝膠電泳檢測．(4)eDNA初級文庫的建立．將eDNA雙鏈用T4DNALigase與pUCm-T連接，電轉(zhuǎn)化到宿主菌DH5a感受態(tài)中，得到匍枝根霉cDNA原始文庫，4℃保存．(5)cDNA文庫的質(zhì)量鑒定．取2LeDNA文庫細菌培養(yǎng)液按1：1000梯度稀釋，均勻涂布于含氨芐青霉素(100t~g／mL)、IPTG(O．1t~mol／mL)和X-gal(20t．tg／mL)的LB平板上37℃正置1h充分吸收后，倒置培養(yǎng)12~16h．根據(jù)
8、菌落計數(shù)法統(tǒng)計文庫庫容及滴度．文庫庫容(cfu)一菌落數(shù)×轉(zhuǎn)化細胞總體積×吸濕率X10ooo／涂布菌體體積(L)，文庫滴度(cfu／mL)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×1ooo／所涂布菌體體積(L)．根據(jù)藍白斑數(shù)量比例來確定重組率．重組率=白斑
