特應(yīng)性皮炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體2、4表達(dá)研究-論文.pdf

《特應(yīng)性皮炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體2、4表達(dá)研究-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。

1、412臨床皮膚科雜志2014年43卷第7期JClinDermat~July20，Vo1．No．論著特應(yīng)性皮炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體2、4表達(dá)研究常晶，張悅，張麗，韓秀萍(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院皮膚科，遼寧沈陽(yáng)110004)【關(guān)鍵詞】皮炎，特應(yīng)性；Toll樣受體；實(shí)時(shí)熒光定量PCR[中圖分類號(hào)】R758．23[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B[文章編號(hào)】1000—4963(2014)07—0412—03特應(yīng)性皮炎(AO)又名異位性濕疹、體質(zhì)性癢疹、1．2方法或遺傳過(guò)敏性濕疹。是一種慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性，炎癥1．2．1分離

2、外周血單個(gè)核細(xì)胞無(wú)菌抽取外周靜脈性皮膚病，病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全明確。血1mL予以3．8％枸櫞酸鈉抗凝備用；在10mL離心皮膚屏障異常及多種致病微生物如金黃色葡萄球菌、管中加入2mL人淋巴細(xì)胞分離液；取新鮮的乙二胺真菌及易感病毒的寄居?？梢哉T發(fā)或加重AD[，但機(jī)四乙酸(EDTA)抗凝血1mL加人等體積PBS顛倒混制尚不清楚。勻后．用注射器吸取，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液液面本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)定并比較AD上方：1500r／min。20℃離心15min，小心吸取第2層患者組和正常對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)

3、胞(PBMCs)Toll云霧狀細(xì)胞，放入新的離心管中，加人PBS至5mL；樣受體(TLR)2、4的表達(dá)。以探討天然免疫炎癥反應(yīng)1500dmin，20cC離心10min．棄去上清．加入PBS至在AD發(fā)病中的作用。5mL，吹吸打散下方細(xì)胞沉淀；1500r／rain，20℃離心10min，棄去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液1mL，吹吸1資料與方法打散下方細(xì)胞沉淀：移入EP管中，一80℃冰箱中保存。1．1資料1．2．2總RNA提取取出樣本，緩慢復(fù)溫融化后，以1．1．1標(biāo)本選擇選擇2011年7月一2011年12月8000

4、r／min．4oC離心2min，棄去上清。加入1mL經(jīng)本院皮膚性病科門(mén)診臨床確診的27例重度急性或Trizol。用微量移液器反復(fù)吹吸直至看不到明顯細(xì)胞沉亞急性AD患)L(AD組)，其中男22例，女5例，年齡淀，室溫靜置5min；加入0．2mL氯仿，用力震蕩15S，2個(gè)月～10歲，中位年齡5個(gè)月。診斷均符合Williams室溫靜置5min；12000r／rain，4℃離心15min，小心吸等f(wàn)3】及Rajka等的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)。病情嚴(yán)重程度根據(jù)取上清液，移入新EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒歐洲AD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(SCOR

5、AD)來(lái)評(píng)分，客觀指標(biāo)=A／B混勻后室溫靜置10min：12000r／min，4℃離心10(A=皮損面積評(píng)分，B=皮損嚴(yán)重程度評(píng)分)，客觀體征min，棄上清，緩慢加入75％乙醇1mL及水20溶評(píng)分確定疾病嚴(yán)重程度：<15分為輕度．15—40分為中解RNA；紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度及濃度；一80℃度，>40分為重度。至少1周內(nèi)未外用過(guò)糖皮質(zhì)激素，冰箱中保存。4周內(nèi)未系統(tǒng)接受過(guò)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及光療。1．2I3反轉(zhuǎn)錄合成eDNA取1支新的0．2mLEP管。對(duì)照組29例為我院小兒外科無(wú)過(guò)敏性皮膚疾病及感在冰上

6、依次加人以下溶液：5xPrimeScript~Buffer(for染性疾病的患兒(正常對(duì)照組)，年齡1～10歲，中位年RealTime)，2~L；PrimeSeript@RTEnzymeMix10．5齡4歲。txL；OligodTPrimer(50txmol／L)，0．5txL；Random61．1．2主要試劑人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊飉ers(100b~mol／L)，0．5~L；TotalRNA；RNaseFree制品科技有限責(zé)任公司)；Trizol(TaKaRa公司)；DNAdH20，Upto10IxL。

7、反應(yīng)條件：37℃，15min，85oC，5S。合成試劑盒及realtime—PCR試劑盒(TaKaRa公司)：1．2．4PCR擴(kuò)增Medline基因庫(kù)檢索各基因全序引物(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)；磷酸鹽緩列，以Primer5．0設(shè)計(jì)引物，GAPDH為內(nèi)參照。(TLR一沖液(PBS)：2．25gNaC1加0．1g，NaH2PO4·2H2O加2：5’一TGATGCTGCCAITI1CTCATTC一3’，5’一CGCAGCTC1．5g，NaHPO·12H：O，蒸餾水定容至250mL，高壓滅TCAGATITrAC

8、CC一3’；TLR一4：5’一AATCCCCTGAGGCA菌。其他：氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、焦碳酸二乙酯TITAGG-3’，5’一AAACTCTGGATGGGG1TrCC一3’；(DEPC)水等GAPDH：5’—CCTCTGACTTCAACAGCGACAC．3’．5’—TCCACCACCCTGTI?GCTGTA一3’)配置PCR反應(yīng)液，在冰上進(jìn)行『SYBR~PremixE