資源描述：
《非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法（報批稿.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS11.220B41DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB21/XXXXX—XXXX非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法Loop-mediatedIsothermalAmplification（LAMP）forRapidDetectionforAfricanSwineFeverVirus（報批稿）本稿完成日期：2020年2月XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/XXXXX—XXXX前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口管理
2、。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心、中國科學(xué)院微生物研究所、洛陽萊普生信息科技有限公司、遼寧佰瑞生物科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊作豐、周晨陽、李秀梅、王宏燕、楊利敏、董娜、劉文軍、張皓淳、姚偉、劉洋、劉近、吳洪濤、任雪建、趙培、李蓉、章春燕、呂園園、陳騰。本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實際情況依法進行評估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話：024-2344
3、7862；標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省動物及產(chǎn)品檢疫中心（沈陽市沈河區(qū)萬柳塘路105號甲），聯(lián)系電話：024-24229579。IDBXX/XXXXX—XXXX非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于非洲豬瘟疫病的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬血液、脾臟、淋巴結(jié)、腎臟等組織樣品中非洲豬瘟病毒核酸的快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，
4、其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求3原理非洲豬瘟病毒是一種DNA病毒，該檢測方法利用6條特異性引物和具有鏈置換能力的DNA聚合酶，在等溫環(huán)境下1h內(nèi)完成擴增，用于非洲豬瘟病毒的核酸檢測。4儀器和器材4.1高速臺式冷凍離心機（離心范圍0～20000r/min）4.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-7℃±1℃冰箱4.3恒溫LAMP擴增儀（型號：Gene-8C）4.4離心管：15ml離心管、1.5ml離心管和0.2mlPCR專用離心管4.5微量移液器：
5、1000μl，200μl，100μl，50μl，20μl，10μl，2μl5試劑和引物5.1樣品處理劑5.2ASFV-R-Mix5.3Bstenzyme5.4D-I礦物油5.5陽性對照5.6陰性對照注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實驗使用的試劑等級均為不含DNA或DNase的分析純或生化試劑；所有試劑均用無菌的容器分裝。1DBXX/XXXXX—XXXX6操作步驟6.1樣品的采集、前處理、存放與運輸6.1.1采樣注意事項采集樣品及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。6.1.2
6、采樣工具15ml離心管和1.5ml離心管經(jīng)121±1℃高壓滅菌20min；剪刀、鑷子經(jīng)160℃干熱滅菌2h，無菌管（真空采血管）。6.1.3組織病料的采集與前處理采集疑似非洲豬瘟病毒感染豬的肺臟、肝臟、腎臟、脾臟等組織樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品約10g于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，加入0.3ml～0.5ml組織懸液混勻，60℃，30min滅活后，將懸液轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，4℃條件下5000r/min離心10min，編號備用。6.1.4全血及血清樣本的采集與前處理使用含有抗凝血
7、劑（EDTA-紫色蓋）的無菌管（真空采血管）從耳靜脈或前腔靜脈采集血液3ml～5ml，60℃，30min滅活后，可直接檢測；若檢測血清，可靜置全血樣本待血清析出后，直接吸取至無菌Eppendorf管中，60℃，30min滅活后，編號備用。6.1.5存放與運輸采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在8h之內(nèi)運送到實驗室檢測。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進行樣品的生物安
8、全標(biāo)識。6.2樣品DNA的提取取10μl前處理過的樣本加入無菌1.5ml離心管，加入10μl樣品處理劑，混勻，94℃裂解2min，瞬時離心，上清即為擴增模板。6.3核酸擴增6.3.1吸取22μlASFV-R-Mix和1μlBstenzyme加入同一個PCR管，吸取2μl步驟6.2處理的核酸擴增模板加至PCR管，混勻，設(shè)置陰陽性對照；6.3.2吸取10μlD-I礦物油輕輕加至PCR管液面，切勿震蕩混勻；6.3.3插入到恒溫擴增儀反應(yīng)槽中；6.
