枯草芽孢桿菌滲透壓調(diào)節(jié)基因prob的克隆和表達

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1、!"卷"期微生物學報$%&’!",%’""##"年!月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$()*+&"##"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!枯草芽孢桿菌滲透壓調(diào)節(jié)基因.’(!的克隆和表達"張小青曹軍衛(wèi)"翟超陳建軍（武漢大學生命科學學院武漢!0##/"）摘要：用456擴增的方法從耐鹽的枯草桿菌中克隆出一個-7089長的:,(片段，經(jīng)功能檢測，證明正向插入片段與大腸桿菌的脯氨酸營養(yǎng)缺陷特性（!"#$1）能夠營養(yǎng)互補。含有該重組質(zhì)粒的大腸桿菌

2、:;+>軟件進行序列分析發(fā)現(xiàn)，該片段第-""?-"0<9)核苷酸編碼一個由0/#個氨基酸組成的蛋白質(zhì)分子，其上游存在非典型的1-#區(qū)，典型的10<區(qū)和核糖體結(jié)合位點，起始密碼子處有最佳翻譯起始效率的側(cè)翼核苷酸序列。將其與@ABA9CB8中的已知基因的序列和編碼的氨基酸序列進行同源性比較，結(jié)果表明該片段與枯草桿菌-3D的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分別為D-=和.#=。證明該基因確實是一個!"#E基因。通過與三十個不同

3、種屬微芽生物!"#E基因的氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在有可能與形成酶的活性中心和三維結(jié)構有密切關系的幾個絕對保守的區(qū)域。關鍵詞：耐鹽枯草芽孢桿菌，!"#E基因，克隆，序列分析中圖分類號：F/D<文獻標識碼：(文章編號：###-23"#.（"##"）#"2#-302#3微生物在高滲環(huán)境的脅迫下，大多都可以合成或從環(huán)境中吸收一些低分子量物質(zhì)來H調(diào)節(jié)自身的滲透壓以平衡外界滲透壓的增高，這些低分子量物質(zhì)，包括G、糖類（海藻［-，"］糖、蔗糖）、醇類、氨基酸及其衍生物（脯氨酸、甜菜堿）。微生物中累積這些低分子量物質(zhì)主要是通過運

4、輸途徑和合成途徑。目前已發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌與脯氨酸運輸有關的蛋白［0，!］有I)JK、4*%$、4*%L、4*%M、4*%N等。而脯氨酸的合成在微生物中是由谷氨酸經(jīng)過"2谷氨酰胺激酶（@G）、"2谷氨酰胺磷酸還原酶（@46）和#’2二氫吡咯2<2羧酸還原酶（4<56）三個酶催化而成，其中催化第一步的@G酶是脯氨酸合成代謝的限速酶。它是受終產(chǎn)物脯氨酸的反饋調(diào)節(jié)。因此@G酶活性的高低對脯氨酸的積累及與枯草芽孢桿菌耐滲透壓［<］能力的高低有關鍵影響。本課題組對枯草芽孢桿菌不同菌株的耐鹽能力進行了測定，發(fā)現(xiàn)它們的耐鹽能力差別很大

5、，其中枯草芽孢桿菌.0-<-的耐鹽能力最高。對其胞內(nèi)相溶溶質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在不含,C5&和含-7!O%&PQ的,C5&的基本培養(yǎng)基中生長時，其自由氨基酸庫中脯氨酸含量從幾乎測不到增至0070ORPR，表明脯氨酸是枯草芽孢桿菌［3］.0-<-的主要相容溶質(zhì)物質(zhì)。本研究報道了枯草芽孢桿菌.0-<-的@G酶基因!"#E的克隆，對其進行了核苷酸序列分析，并在大腸桿菌中進行了功能測定。希望研究該基因與細胞滲透壓調(diào)節(jié)的關系，為闡明耐鹽微生物的耐鹽機理奠定了基礎。"通訊聯(lián)系人作者簡介：張小青（-./01），男，在讀碩士生，目前從

6、事分子微生物學方面的研究。收稿日期："##-2#32#!，修回日期："##-2#.2"3#0/微生物學報/(卷!材料和方法!"!材料!#!#!菌株和質(zhì)粒：枯草芽孢桿菌（!"#$%%&’’&()$%$’）!"#$#，由中國典型菌種保藏中心（%%&%%）提供；大腸桿菌#’#($［(*!)#+,#*"+"!（%"#*+-!）+,#.］，購于中國微生物菌種保藏管理委員會的普通微生物中心（%+,%%）；大腸桿菌（/*#-%$）-.$!［’&*///!%"#0#0!（）3’45#2+,#.%,64.%78+.!0)3$3#+,%"

7、#］，由本實驗室保存。4,-3&載體，由"1)%"#1!2#$45%#1載體改造而成。!#!#$試劑和培養(yǎng)基：4,-3&載體克隆試劑盒，6%7擴增試劑盒，均購于&89878公司。低熔點瓊脂糖購自:;<=8公司，限制性內(nèi)切酶及其他試劑均購自華美公司。>?培養(yǎng)基按照文獻［2］的方法配制。?,培養(yǎng)基成分為：（@.）(:A/#<，9(.6A/2<，9.(6A/"<，,<:A/·2.(A)’#<，葡萄糖#)<，用水定容至#)))=>。B,培養(yǎng)基是在?,培養(yǎng)基中加入檸檬酸三鈉)’$。!#$方法!#$#!染色體-@D的制備：枯

8、草芽孢桿菌!"#$#基因組-@D制備參照林萬明的方法，用［1］酚、氯仿進行純化。!#$#$引物設計及6%7擴增：登錄+EF?8FG查找相關的*+-!基因序列，主要參考枯草芽孢桿菌#01的*+-!基因序列，運用6%C